NRg-1β對(duì)CS2誘發(fā)的初級(jí)傳入神經(jīng)元毒性的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、二硫化碳(carbon disulfide，CS2)是一種在工業(yè)上應(yīng)用的無(wú)色有機(jī)溶劑，可對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)產(chǎn)生毒性作用。雖然CS2所致的神經(jīng)毒性已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)一個(gè)世紀(jì)之久，然而迄今為止，CS2所致神經(jīng)毒性的作用機(jī)制至今尚未被完全闡明。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin-1β，NRG-1β)可對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生多種調(diào)節(jié)作用。NRG-1β是否能夠調(diào)節(jié)DRG神經(jīng)元的生長(zhǎng)與遷移目前仍不清楚。本研究

2、利用器官型培養(yǎng)的胎鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)組織塊培養(yǎng)模型，對(duì)CS2的神經(jīng)毒性作用和NRG-1β神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了系列研究。
　　 第一部分二硫化碳對(duì)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)和遷移的抑制作用
　　 為了檢測(cè)CS2的神經(jīng)毒性作用，器官型培養(yǎng)的DRG組織塊分為以下各組:
　　 (1)0.01 mmol/L CS2組:DRG組織塊用0.01 mmol/L CS2孵育;
　　 (

3、2)0.1 mmol/LCS2組:DRG組織塊用0.1 mmol/L CS2孵育;
　　 (3)1.0 mmol/L CS2組:DRG組織塊用1.0mmol/L CS2孵育;
　　 (4)對(duì)照組:DRG組織塊持續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)孵育作為對(duì)照。
　　 培養(yǎng)3d后，在倒置相差顯微鏡下檢測(cè)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，用微觀相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated protein 2，MAP2)進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，檢測(cè)D

4、RG神經(jīng)元的遷移。結(jié)果顯示，0.01 mmol/L CS2孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為15.00±2.61條;0.1 mmol/L CS2孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為11.17±1.47條;1.0mmol/L CS2孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為8.00±1.41條;對(duì)照組神經(jīng)纖維束的數(shù)目為17.83±2.48條。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，0.01 mmol/L CS2孵育的標(biāo)本的神經(jīng)纖維束的數(shù)目與對(duì)照組相比P＜0.05，0.1 mmol/L和

5、1.0 mmol/L CS2孵育的標(biāo)本的神經(jīng)纖維束的數(shù)目與對(duì)照組相比P＜0.001。0.01 mmol/L CS2孵育的標(biāo)本，遷移神經(jīng)元的數(shù)目為79.50±9.40個(gè);0.1 mmol/LCS2孵育的標(biāo)本，遷移神經(jīng)元的數(shù)目為62.50±14.15;1.0 mmol/L CS2孵育的標(biāo)本，遷移神經(jīng)元的數(shù)目為34.67±7.58;對(duì)照組遷移神經(jīng)元的數(shù)目為99.33±15.16。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，0.01 mmol/L CS2孵育的標(biāo)本的遷移神經(jīng)

6、元數(shù)目與對(duì)照組相比P＜0.01，0.1 mmol/L和1.0 mmol/LCS2孵育的標(biāo)本的遷移神經(jīng)元數(shù)目與對(duì)照組相比P＜0.001。這些結(jié)果表明CS2對(duì)DRG神經(jīng)元突起生長(zhǎng)和神經(jīng)元遷移具有抑制作用并呈劑量依賴關(guān)系。
　　 第二部分神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β對(duì)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)和遷移的調(diào)節(jié)作用
　　 器官型培養(yǎng)的DRG組織塊分為以下各組:
　　 (1)5 nmol/L NRG-1β組:DRG組織塊用5 nmol/L N

7、RG-1β孵育;
　　 (2)10 nmol/LNRG-1β組:DRG組織塊用10nmol/L NRG-1β孵育;
　　 (3)20 nmol/L NRG-1β組:DRG組織塊用20 nmol/L NRG-1β孵育;
　　 (4)對(duì)照組:DRG組織塊持續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)孵育作為對(duì)照。
　　 培養(yǎng)3d后，在倒置相差顯微鏡下檢測(cè)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，用神經(jīng)絲蛋白-200(neurofilament 200，NF-200

8、)進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，檢測(cè)DRG神經(jīng)元的遷移。結(jié)果顯示，5 nmol/LNRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為23.0土2.2條;10 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為27.0±2.7條;20 nmol/LNRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為30.8±3.7條;對(duì)照組神經(jīng)纖維束的數(shù)目為19.0±2.2條。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，5 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本的神經(jīng)纖維束的數(shù)目與對(duì)照組相比P＜0.05，10

9、 nmol/L和20 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本的神經(jīng)纖維束的數(shù)目與對(duì)照組相比P＜0.001。5 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)元遷出的數(shù)目為39.6±5.0個(gè);10 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)元遷出的數(shù)目為54.6±6.7個(gè);20 nmol/LNRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)元遷出的數(shù)目為62.2±5.7個(gè);對(duì)照組神經(jīng)元遷出的數(shù)目為31.6±4.0個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，5nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)

10、本神經(jīng)元遷出的數(shù)目與對(duì)照組相比P＜0.05，10 nmol/L和20 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本神經(jīng)元遷出的數(shù)目與對(duì)照組相比P＜0.001。這些結(jié)果表明，NRG-1β可促進(jìn)體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)節(jié)組織塊神經(jīng)突起的生長(zhǎng)和神經(jīng)節(jié)組織塊內(nèi)神經(jīng)元向周圍的遷移并呈劑量依賴性。
　　 第三部分神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β對(duì)二硫化碳毒性的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　 為了檢測(cè)NRG-1β是否會(huì)對(duì)具有CS2毒性的DRG神經(jīng)元的生長(zhǎng)和遷

11、移具有保護(hù)作用以及NRG-1β發(fā)生作用機(jī)制，器官型培養(yǎng)的DRG組織塊分為以下各組:
　　 (1) CS2組:DRG組織塊用0.1 mmol/L CS2孵育;
　　 (2) CS2+NRG-1β組: DRG組織塊用0.1 mmol/L CS2+20 nmol/L NRG-1β孵育;
　　 (3) CS2+LY294002+NRG-1β組:DRG組織塊用0.1 mmol/L CS2+10μmol/L LY294002

12、+20 nmol/LNRG-1β孵育，其中LY294002在加入NRG-1β30 min前加入;
　　 (4) CS2+PD98059+ NRG-1β組:DRG組織塊用0.1 mmol/L CS2+10μ mol/L PD98059+20 nmol/LNRG-1β孵育，其中PD98059在加入NRG-1β30 min前加入;
　　 (5)CS2+LY294002+ PD98059+NRG-1β組:DRG組織塊用0.1 m

13、mol/L CS2+10μmol/L LY294002+10μmol/L PD98059+20 nmol/L NRG-1β孵育，其中LY294002和PD98059在加入NRG-1β30 min前加入;
　　 (6)對(duì)照組:DRG組織塊持續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)孵育作為對(duì)照。
　　 培養(yǎng)3d后，在倒置相差顯微鏡下檢測(cè)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，用NF-200進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，檢測(cè)DRG神經(jīng)元的遷移。結(jié)果顯示，經(jīng)定量計(jì)數(shù)神經(jīng)纖維束的數(shù)目為:

14、r>　　 (1)0.1 mmol/L CS2孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為11.5±1.5條;
　　 (2)0.1 mmol/L CS2+20 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為19.2±1.7條;
　　 (3)0.1 mmol/L CS2+10 mol/L LY294002+20 nmol/LNRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為17.0±1.2條:
　　 (4)0.1 mmol/L

15、 CS2+10μmol/L PD98059+20 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為15.8±1.2條;
　　 (5)0.1mmol/L CS2+10μmol/L LY294002+10μmol/L PD98059+20 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)纖維束的數(shù)目為15.5±1.4條;對(duì)照組神經(jīng)纖維束的數(shù)目為19.7±1.3條。
　　 經(jīng)定量計(jì)數(shù)神經(jīng)元遷移的數(shù)目為:
　　 (1)

16、0.1 mmol/L CS2孵育的標(biāo)本，神經(jīng)元遷出的數(shù)目為19.9±2.9個(gè);
　　 (2)0.1 mmol/L CS2+20 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)元遷出的數(shù)目為33.3±4.1個(gè);
　　 (3)0.1 mmol/L CS2+10μmol/L LY294002+20 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)元遷出的數(shù)目為27.5±3.2個(gè);
　　 (4)0.1 mmol/L CS2+10μ

17、mol/L PD98059+20 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)元遷出的數(shù)目為28.5±2.8個(gè);
　　 (5)0.1 mmol/LCS2+10μmol/L LY294002+10μmol/L PD98059+20 nmol/L NRG-1β孵育的標(biāo)本，神經(jīng)元遷出的數(shù)目為24.3±2.9個(gè);對(duì)照組神經(jīng)元遷出的數(shù)目為34.8±4.6個(gè)。
　　 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，0.1 mmol/L CS2孵育使神經(jīng)纖維束和神經(jīng)元遷

18、出的數(shù)目與對(duì)照組相比減少，20 nmol/L NRG-1β恢復(fù)由CS2引起的神經(jīng)纖維束和神經(jīng)元遷出數(shù)目的減少，單獨(dú)應(yīng)用LY294002或PD98059或者同時(shí)應(yīng)用LY294002和PD98059可部分阻斷NRG-1β的作用。以上結(jié)果表明，NRG-1β對(duì)具有CS2毒性的DRG神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)和神經(jīng)元的遷移有一定的保護(hù)作用，磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)