抗體靶向的長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA和siRNA轉(zhuǎn)染的制劑學(xué)研究.pdf

1、近年來，我國女性乳腺癌的發(fā)病率迅速上升。乳腺癌已經(jīng)是危害我國婦女健康的主要惡性腫瘤之一。目前，乳腺癌的常用治療手段主要是手術(shù)治療、放射治療和化療。這些手段雖然可使患者獲得較高的生存率甚至治愈，但術(shù)后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的問題仍然是困擾學(xué)者們的一大難題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及免疫學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展和人類對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，基因治療逐漸成為腫瘤生物學(xué)治療中的重要組成部分，在乳腺癌治療中顯示出良好的應(yīng)用價(jià)值，并且取得了一定的效果，日漸成為一

2、項(xiàng)有前景的治療選擇。 目前基因治療的研究和臨床應(yīng)用中常用的載體分為病毒載體和非病毒載體，各個(gè)載體均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，病毒載體主要的潛在缺點(diǎn)包括：①致病可能性；②免疫原性；③大規(guī)模生產(chǎn)的困難性。而非病毒導(dǎo)入系統(tǒng)正受到更多的關(guān)注，它的主要的優(yōu)點(diǎn)包括安全，容易大規(guī)模生產(chǎn)等，主要缺點(diǎn)是不能獲得較高水平的基因?qū)牒捅磉_(dá)[1-3]。陽離子脂質(zhì)體(Cationic liposomes，CL)是目前用于基因治療的研究最廣泛的非病毒類載體之一，具有

3、毒性低、轉(zhuǎn)移的核苷酸大小范圍廣(從寡核苷酸到人工染色體均可)、制備方法較簡單等優(yōu)點(diǎn)。但是該載體仍存在轉(zhuǎn)染效率較低、靶向性差等問題。設(shè)計(jì)合理的CL微粒給藥體系，以提高目的基因的高效靶向表達(dá)是當(dāng)前藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[3-4]。 在乳腺癌患者中，約有25-30％乳腺癌病人的癌組織表達(dá)HER2，而且這些HER2陽性的病例往往發(fā)展快，對(duì)多種化療和內(nèi)分泌治療不敏感，預(yù)后較差，容易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。 HER2是具有跨膜酪氨酸激酶活性的生長

4、因子受體。目前抗HER2治療的途徑主要有以下幾類：①抗HER2單克隆抗體，通過封閉乳腺癌細(xì)胞表面HER2受體，阻斷其與各種生長因子的結(jié)合，從而抑制受體激活：②酪氨酸激酶抑制劑；③反義基因技術(shù)。但由于抗HER2單克隆抗體本身限制及酪氨酸激酶抑制劑副作用較嚴(yán)重，而反義基因方法抑制基因表達(dá)的效果又較弱，故他們都不能達(dá)到滿意的臨床效果。因此，開發(fā)一種更加有效、安全的抗HER2藥物成為研究的熱點(diǎn)。 本研究制備的制劑，以靶向乳腺癌細(xì)胞株HE

5、R2抗原的人源化單克隆抗體Fab’片段作為載質(zhì)粒DNA或小干擾RNA的PEG化的免疫脂質(zhì)體的靶向配體，這樣可以特異性的將質(zhì)粒DNA或小干擾RNA運(yùn)載到體內(nèi)HER2高表達(dá)的乳腺癌組織。本研究同時(shí)進(jìn)行了靶向性的免疫長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染的制劑學(xué)研究及體外細(xì)胞學(xué)研究(Long-circulation Cationic Immunoliposomes，CIL)及非靶向性的長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體(Long-circulating Cat

6、ionic liposomes，LCL，)介導(dǎo)DNA和siRNA轉(zhuǎn)染的制劑學(xué)研究及體外細(xì)胞學(xué)研究。 對(duì)于非靶向的陽離子脂質(zhì)體(含PEG和不含PEG)，粒徑分析結(jié)果為：在未復(fù)合物核酸之前，陽離子脂質(zhì)體的粒徑為150 nm左右。一旦復(fù)合核酸，脂質(zhì)體/核酸復(fù)合物的粒徑呈有規(guī)律的變化。隨著DC-chol/核酸比例的升高，脂質(zhì)體/核酸粒徑呈先升高后降低的趨勢。脂質(zhì)體/DNA的峰值出現(xiàn)在DC-chol/DNA=2，而脂質(zhì)體/siRNA的峰值

7、出現(xiàn)在DC-chol/DNA=3或5。非靶向陽離子脂質(zhì)體的zeta電位一般來講均為正值，隨著DC-chol/DNA或siRaNA比值越來越高，脂質(zhì)體的zeta電位越來越大，然而超過一定數(shù)值時(shí)，zeta電位出現(xiàn)平臺(tái)期。 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)DC-chol/DNA=2，凝膠恰好將DNA阻滯??；而siRNA的包封率曲線結(jié)果：當(dāng)DC-chol/siRNA=3或5時(shí)，絕大部分的脂質(zhì)體的siRNA包封率接近100％。PEG對(duì)非靶向陽離子脂質(zhì)

8、體的DNA結(jié)合能力影響輕微。然而，PEG化能大大減弱非靶向陽離子脂質(zhì)體對(duì)SiRNA的結(jié)合能力，甚至在DC-chol/siRNA＞15時(shí)，脂質(zhì)體均不能將siRNA完全阻滯住。 陽離子脂質(zhì)體的核酸穩(wěn)定性分析是通過DNA的DNaseI酶切實(shí)驗(yàn)和siRNA的血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證的。結(jié)果表明非靶向陽離子脂質(zhì)體能顯著增加核酸的穩(wěn)定性。 非靶向陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以DC-chol和DOPE的比例，DC-chol和核酸的質(zhì)量比、PEG

9、(聚乙二醇)修飾的程度以及有無血清全面評(píng)估了影響陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的因素，得到了最適合進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的DOPE/DC-chol脂質(zhì)體。于質(zhì)粒DNA來說，最優(yōu)的DC-chol/DOPE比例為1/2，而對(duì)于siRNA來說，最優(yōu)的DC-chol/DOPE比例為1。PEG對(duì)本研究中的陽離子脂質(zhì)體影響巨大，隨著PEG含量的增加，轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。血清對(duì)非靶向陽離子脂質(zhì)體的DNA轉(zhuǎn)染效率影響不大。有血清轉(zhuǎn)染和無血清轉(zhuǎn)染沒有明顯的轉(zhuǎn)染效率差異；

10、血清對(duì)DC-chol/DOPE脂質(zhì)體的siRNA轉(zhuǎn)染效率影響較大。對(duì)于不同配比的DC-chol/DOPE脂質(zhì)體來說，無血清轉(zhuǎn)染效率要高于有血清轉(zhuǎn)染效率。 對(duì)于靶向HER2的免疫陽離子脂質(zhì)體(Liposomes conjugated with Anti-HER2 Fab'，HER2-Flip)，本研究將Anti-HER2 Fab'作為靶向性抗體片段連接于含4％PEG的陽離子脂質(zhì)體的表面--抗體靶向的方式，并通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HER