長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體介導(dǎo)放射反義治療乳腺癌基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的探索125I/131I-寡核苷酸(ON)和125I/131I-ON-長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(LCL)的制備工藝；比較bcl-2ASON和bcl-2/bcl-xlASON的反義治療療效；研究bcl-2ASON和bcl-2/bcl-xlASON陰離子LCL(NA)介導(dǎo)的放射反義治療的療效及其機(jī)理，并與陽(yáng)離子長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(PA)、中性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(A-D)、普通脂質(zhì)體(CA)以及131I-ASON(FA)比較；評(píng)價(jià)內(nèi)照射治療與反義治療相結(jié)合對(duì)提高療

2、效的貢獻(xiàn)。方法(1)以TlCl3為氧化劑，采用直接標(biāo)記法進(jìn)行放射性碘標(biāo)記ON。(2)以0.50：0.35：0.06：0.10、10：4：1：3.3、2：1：0.2：0.66、0.50：0.29：0.06：0.12摩爾比量取PC、CH、DSPE-PEG2000或DPPG或DDAB，分別溶解于不同體積比的有機(jī)溶劑混合液，采用改進(jìn)的逆相蒸發(fā)法制備NA、PA、CA和A-D，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行相應(yīng)鑒定。(3)測(cè)定MCF-7細(xì)胞對(duì)NA、PA、A-D、C

3、A和FA的攝取。(4)NA、PA、A-D、CA和FA與MCF-7細(xì)胞孵育后一定時(shí)間，HE染色觀察細(xì)胞凋亡、MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活與增殖、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中bcl-2癌蛋白的表達(dá)量。(5)放射性示蹤方法研究NA、PA、A-D、CA和FA在昆明大白兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、在正常小鼠體內(nèi)組織分布，NA和和FA在乳腺癌SD大鼠(瘤鼠)體內(nèi)的組織分布，并進(jìn)行瘤鼠放射性反義顯像。(6)N-甲基亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)建立乳腺癌動(dòng)物模型并進(jìn)行組織學(xué)鑒定

4、。(7)瘤鼠尾靜脈注射不同藥物后30天，HE染色觀察不同治療組間瘤鼠腫瘤組織的病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)分析檢測(cè)乳腺癌組織中bcl-2蛋白表達(dá)水平，比較不同組間腫瘤體積的變化、瘤重抑制率和腫瘤抑制時(shí)間，并觀察藥物毒副作用。(8)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以X±SD表示，用SPSS11.5軟件行One-wayANOVA或t-test，p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間依次為60℃×30min(pH5.0)、60℃×45min(

5、pH5.0)和60℃×60min(pH7.0)，ON的放射性碘標(biāo)記率71.66±7.73％，125I-ON放化純、比活度分別為98.33±0.39％和4.09±0.11MBq·nmol-1；37℃條件下125I-ON在0.01MHEPES洗脫液(pH=7.4)和人血清中穩(wěn)定，4h放化純分別為94.53±0.76％和81.66±0.58％。(2)以摩爾比0.50：0.35：0.06：0.10、0.50：0.29：0.06：0.12、0.5

6、0：0.35：0.06、0.50：0.35分別量取PC：CH：DSPE-PEG2000：DPPG、PC：CH：DSPE-PEG2000：DDAB、PC：CH：DSPE-PEG2000和PC：CH(10mg.ml-1)，先后溶解于氯仿/異丙醚(1：1V/V)和氯仿/甲醇混合液(2：1,v/v)、在旋轉(zhuǎn)速度為200rpm、水浴溫度41～42℃條件下，制備的脂質(zhì)體形態(tài)規(guī)則，粒徑小而且分布均勻。(3)擠壓前各種脂質(zhì)體粒徑和多分散度(PDI)分別

7、為504±31.76nm、0.107±0.008。擠壓后所有脂質(zhì)體粒徑115nm±8.5nm，PDI=0.103±0.002；NA和PA的Zeta電位分別為-29.23±0.45mV和+41.91±0.58Mv。(4)超速離心法測(cè)定NA和PA包封率分別為70.28±1.84％、71.57±2.21％(p＞0.05)，與A-D(41.66±2.03％)和CA(34.33±3.17％)的差異有顯著性(p＜0.05)。(5)MCF-7細(xì)胞與N

8、A孵育后3.16±0.76h，細(xì)胞攝取達(dá)高峰(32.51±1.44％)，高于PA(21.92±2.07％)、A-D(16.26±1.01％)、CA(13.24±2.06％)和FA(9.55±1.43％)，p＜0.05。(6)與其他各組比較，131I-bcl-2/bcl-xlASON-陰離子LCL(NA-D)組MCF-7細(xì)胞凋亡最明顯，bcl-2癌蛋白的熒光強(qiáng)度最弱(1.32±0.52)，bcl-2蛋白表達(dá)抑制率最大(80.53％)，細(xì)胞

9、存活率最低(0.005±0.001％)(p＜0.001)。(7)NA、PA、A-D、CA和FA在昆明大白兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)符合二房室模型。與CA、PA比較，NA組T1/2α(22.11±1.16min)、T1/2β(393.33±28.58min)和血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC，4119.66±46.96)增加(p＜0.05)。(8)與CA相比，肝臟攝取NA減少30％(p＜0.05)。瘤鼠腫瘤攝取NA-D于10h達(dá)高峰(6.23±0

10、.23％ID/g)，腫瘤/血液和腫瘤/肌肉比值分別為6.29±0.76和10.55±0.68，高于FA(p＜0.001)。NA-D注射組瘤鼠放射性反義顯像見腫瘤于10h顯示最清晰。而131I-SON-陰離子LCL(NS)和131I-NON-陰離子LCL(NN)組腫瘤始終顯示不清。(7)不同藥物治療瘤鼠后30天，與AL、A-D、PA、CA、NS和NN比較，NA-D組腫瘤抑制時(shí)間長(zhǎng)、瘤重抑制率高、bcl-2癌蛋白表達(dá)減少(p＜0.001)、

11、腫瘤體積增大不明顯(p＜0.05)；其中以0.2mCiNA-D治療組腫瘤抑制時(shí)間最長(zhǎng)、治療后30天瘤重抑制率最高、bcl-2癌蛋白表達(dá)最低，分別為18.3±1.8天、64.53±2.54％和1.2±0.2(p＜0.001)；FA、NS和NN組腫瘤體積明顯增大，是治療初體積的3-4倍(p＜0.05)，腫瘤抑制時(shí)間僅為3-4天、瘤重抑制率＜14％(p＜0.05)。(8)治療前后瘤鼠體重的差異，以及不同組間瘤鼠血細(xì)胞、血生化和肝腎功能指標(biāo)的差

12、異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。與對(duì)照組比較，治療組瘤鼠的血糖輕度升高(p＜0.05)。結(jié)論改變放射性碘標(biāo)記ON反應(yīng)條件獲得的125I/131I-ASON穩(wěn)定性好、比活度高；采用改進(jìn)的逆相蒸發(fā)法制備的各種脂質(zhì)體粒徑小、分布均勻、包封率高、zeta電位適宜，體內(nèi)外穩(wěn)定；NA能增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的攝取能力，改變131I-ASON的體內(nèi)分布和藥代動(dòng)力學(xué)、延長(zhǎng)其半衰期(T1/2)和提高其穩(wěn)定性，抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)bcl-2蛋白的表達(dá)、具有明顯的生物學(xué)