活體成像技術(shù)評價(jià)脂質(zhì)體介導(dǎo)的乳腺癌基因治療.pdf

1、研究背景：隨著近年來乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)增長，病死率居高不下，尋求一種新的有效的腫瘤治療手段，已成為乳腺癌治療研究領(lǐng)域亟需解決的問題。自殺基因胸腺嘧啶核苷激酶(TK)在抗腫瘤研究中有較大的應(yīng)用價(jià)值。陽離子脂質(zhì)體作為一種非病毒基因載體，能夠有效的促進(jìn)體內(nèi)和體外基因的轉(zhuǎn)染，具有基因負(fù)載量高，安全性好等優(yōu)勢，已成功的應(yīng)用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和腫瘤治療的研究中。然而，對于陽離子脂質(zhì)體在活體生物體內(nèi)介導(dǎo)外源性基因轉(zhuǎn)移的行為，尚缺乏有效的追蹤監(jiān)測平臺以及準(zhǔn)

2、確評價(jià)轉(zhuǎn)染效率的技術(shù)手段。而基于分子影像技術(shù)的活體成像系統(tǒng)，具有無創(chuàng)傷性、可視性和量化的特點(diǎn)，可以填補(bǔ)這一研究方法的空白。以熒光素酶報(bào)告基因?yàn)榛A(chǔ)的小動物活體成像，可以用來標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，隨后追蹤標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞在動物體內(nèi)的命運(yùn)；也可以用來標(biāo)記研究的目的基因，觀察活體動物體內(nèi)基因的表達(dá)。當(dāng)對兩種或以上的熒光素酶報(bào)告基因同時(shí)或先后進(jìn)行活體成像時(shí)，則可在同一時(shí)間段內(nèi)觀察到同一個體體內(nèi)發(fā)生的兩種以上的生物學(xué)過程。這種基于雙報(bào)告基因或多報(bào)告基因的熒

3、光素酶活體成像技術(shù)，為我們在本研究中評價(jià)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效率及探索其在腫瘤治療中的應(yīng)用，評價(jià)自殺基因?qū)δ[瘤的治療作用等提供了潛在的平臺。
　　 研究目的：我們采用活體成像技術(shù)，目的在于跟蹤監(jiān)測移植的乳腺腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的命運(yùn)，觀察移植瘤的生長、衰退和對治療的反應(yīng)，并評價(jià)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的TK自殺基因在腫瘤組織內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染效率，以及脂質(zhì)體介導(dǎo)的TK自殺基因治療對乳腺癌的抗腫瘤效果。我們同時(shí)探索螢火蟲熒光素酶、海腎熒

4、光素酶雙報(bào)告基因的活體成像技術(shù)在研究腫瘤的治療效果和評價(jià)脂質(zhì)體基因傳遞效率等多方面的應(yīng)用價(jià)值。
　　 研究方法：首先為了驗(yàn)證直接注射到組織內(nèi)的質(zhì)粒DNA的表達(dá)狀況，和探索陽離子脂質(zhì)體促進(jìn)DNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染的作用，我們在BALB/c小鼠后肢進(jìn)行肌肉內(nèi)注射：右側(cè)后肢肌肉內(nèi)注射陽離子脂質(zhì)體和Rluc-RFP-TIK質(zhì)粒DNA(表達(dá)海腎熒光素酶-紅色熒光蛋白-截短的胸腺嘧啶核苷激酶融合蛋白)的混合物，左側(cè)注射用PBS稀釋的同質(zhì)量的Rluc-

5、RFP-TTK質(zhì)粒DNA。每隔一周進(jìn)行Rluc信號的活體成像，觀察基因的表達(dá)。然后，我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，使用一個表達(dá)融合蛋白(增強(qiáng)的綠色熒光蛋白-螢火蟲熒光素酶)的報(bào)告基因質(zhì)粒eGFP-Fluc(DF)標(biāo)記BALB/c小鼠來源的乳腺癌細(xì)胞系4T1，經(jīng)過流式細(xì)胞儀篩選GFP陽性細(xì)胞群，得到穩(wěn)定表達(dá)eGFP-Fluc的4T1細(xì)胞(4T1-DF)。將4T1-DF細(xì)胞以5×105/接種部位的細(xì)胞數(shù)注射接種至雌性BALB/c小鼠肩部兩側(cè)皮下，

6、使其成瘤。從接種的第2天起，每隔4天，重復(fù)進(jìn)行Fluc的小鼠活體成像，觀察腫瘤的生長狀況，直到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在腫瘤細(xì)胞接種一周后，連續(xù)重復(fù)3次進(jìn)行腫瘤內(nèi)基因注射治療：每只荷瘤小鼠的一側(cè)腫瘤內(nèi)給予陽離子脂質(zhì)體和Rluc-RFP-TTK質(zhì)粒DNA的混合物，另一側(cè)給予以PBS稀釋的相等質(zhì)量的Rluc-RFP-TTK質(zhì)粒DNA。在3天后開始每天腹腔給予更昔洛韋藥物。自腫瘤內(nèi)基因注射第2天開始，每隔4天進(jìn)行Rluc的小鼠活體成像觀察Rluc-RF

7、P-TTK質(zhì)粒的表達(dá)。在持續(xù)給予更昔洛韋藥物約半個月后，分離腫瘤組織，進(jìn)行冰凍切片，用免疫熒光檢測腫瘤組織內(nèi)的RFP蛋白表達(dá)，TUNEL檢測腫瘤組織內(nèi)的凋亡，和用CD31抗體對腫瘤內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞染色觀察腫瘤內(nèi)血管新生情況。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)，單純質(zhì)粒注射可以在肌組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)蛋白，表達(dá)持續(xù)的時(shí)間至少在一個半月，陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)?；旌献⑸淇梢燥@著提高這種質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率從而提高表達(dá)水平。4T1-DF乳腺癌模型的自殺基因治療實(shí)驗(yàn)中，我

8、們發(fā)現(xiàn)在有脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移組腫瘤內(nèi)Rluc信號強(qiáng)度要明顯高于無脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移組(對照組)；脂質(zhì)體介導(dǎo)的TTK自殺基因治療使移植瘤縮小的程度和阻抑腫瘤生長的程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組；對腫瘤組織切片的RFP免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在脂質(zhì)體介導(dǎo)的TTK自殺基因治療組的腫瘤組織內(nèi)，RFP表達(dá)明顯較多；TUNEL凋亡染色提示腫瘤組織內(nèi)有凋亡的發(fā)生，脂質(zhì)體介導(dǎo)的TTK自殺基因治療組的腫瘤內(nèi)凋亡細(xì)胞的比例明顯高于對照組；對腫瘤內(nèi)CD31的熒光染色說明

9、，腫瘤內(nèi)血管新生的數(shù)量在脂質(zhì)體介導(dǎo)的TTK自殺基因治療組內(nèi)較對照組有所下降。
　　 結(jié)論：基于雙報(bào)告基因的活體成像是研究脂質(zhì)體介導(dǎo)的腫瘤基因治療、評估陽離子脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)移效率的有效工具。eGFP-Fluc雙融合報(bào)告基因用于標(biāo)記腫瘤細(xì)胞和追蹤腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的命運(yùn)，Rluc-RFP-TTK三重融合基因分別以Rluc信號和RFP來報(bào)告TTK自殺基因在腫瘤內(nèi)的表達(dá)，都是可用于腫瘤治療研究的重要手段。陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的TTK自殺基因治療在