載DOX-IR-780脂質(zhì)體的制備及其在乳腺癌光熱-化療聯(lián)合治療中的應(yīng)用.pdf

1、乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，其主要治療方式是手術(shù)、放療、化療。然而，手術(shù)治療和放療、化療對病人損傷較大，且化療普遍面臨著多藥耐藥的問題。因此，尋找一種非侵入的病人能耐受的腫瘤治療方法是臨床研究的熱點(diǎn)。熱療是通過各種方法使全身和（或）局部組織加熱至有效治療的溫度范圍并維持一定時(shí)間來殺滅腫瘤細(xì)胞的一種方法。熱療本身對腫瘤細(xì)胞有直接的殺傷作用，熱療能使癌細(xì)胞的線粒體膜、溶酶體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜發(fā)生破壞，并且由于溶酶體酸性水解酶的大量釋放，導(dǎo)

2、致胞膜破裂，胞漿外溢;造成DNA損傷的增加及抑制DNA的合成;影響相關(guān)基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。激光熱療相較于手術(shù)、放療、化療，有著無創(chuàng)或微創(chuàng)，恢復(fù)時(shí)間短，并發(fā)癥少的優(yōu)點(diǎn)。但由于腫瘤內(nèi)部熱分布不均勻，尤其是在大血管周邊區(qū)域，熱量隨著血液循環(huán)消散，單純熱療很難殺死所有腫瘤細(xì)胞，治療結(jié)果差異大。因此，仍需要聯(lián)合其他治療方法來提高熱療的療效，臨床研究表明，熱療-化療的聯(lián)合治療可以明顯增強(qiáng)抗腫瘤療效。
　　本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種基于溫度敏感

3、性脂質(zhì)體載阿霉素和IR-780的腫瘤熱療化療聯(lián)合治療的藥物控釋系統(tǒng)。該系統(tǒng)中，脂溶性的IR-780包封在脂質(zhì)雙層中，水溶性的化療藥阿霉素(Doxorubicin，DOX)包裹在脂質(zhì)體的親水內(nèi)核中。該系統(tǒng)可利用脂質(zhì)體高效負(fù)載化療藥物，在近紅外激光照射下光熱制劑吸熱同時(shí)促進(jìn)溫度敏感性脂質(zhì)體的藥物釋放。經(jīng)過和修飾后的納米粒具有很好的生物相容性和很低的生物毒性，可避免單核巨噬系統(tǒng)的吞噬。在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，該系統(tǒng)能夠同時(shí)發(fā)揮熱療與化療的聯(lián)

4、合治療效果，熱化療相比單純的化療或熱療，可顯著提高抗腫瘤效果。
　　第一章:載DOX/IR-780脂質(zhì)體的制備與表征
　　目的:
　　制備DOX/IR-780脂質(zhì)體并進(jìn)行表征，探索其用于乳腺癌光熱-化療的可行性。
　　方法:
　　一、主要試驗(yàn)材料
　　實(shí)驗(yàn)材料:磷脂(DPPC，MPPC，DSPE-PEG2000);阿霉素;IR-780碘化物。
　　實(shí)驗(yàn)儀器:恒溫金屬浴;Malvern激光粒度儀;

5、熒光分光光度計(jì);紅外熱像儀。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　采用薄膜水化法制作DOX/IR-780溫敏脂質(zhì)體(DOX-IR-780temperature-sensitive-liposomes， DITSL)及 DOX溫敏脂質(zhì)體(DOXtemperature-sensitive-liposomes， DTSL)、 IR-780溫敏脂質(zhì)體(IR-780temperature-sensitive-liposomes，ITSL)并對各脂質(zhì)

6、體進(jìn)行表征。用Malvem激光粒度儀測得各脂質(zhì)體的粒徑、表面電位及多分散系數(shù)。同時(shí)對各脂質(zhì)體的紫外吸光特性及光熱效應(yīng)進(jìn)行測量。并驗(yàn)證DITSL在高溫及激光輻照下的藥物釋放可控性。
　　結(jié)果:
　　1.成功制備載有DOX和IR-780脂質(zhì)體，其中IR-780溶在脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層中，DOX包封在脂質(zhì)體的親水內(nèi)核中。
　　2.DITSL粒徑在138.98nmnm左右，PDI約0.32。DTSL、ITSL和空白脂質(zhì)體的粒徑均小于

7、100nm。所有脂質(zhì)體略帶負(fù)電位。各載藥溫敏脂質(zhì)體藥物包封率均在90％以上。DITSL同時(shí)在793nm和492nm有顯著吸收峰，符合IR-780和DOX的吸收特性。
　　3.在0.8W/cm2激光照射五分鐘內(nèi)，DITSL和ITSL溶液溫度升高迅速，而DTSL和PBS組只有少量的溫度升高。
　　4.在37℃、42℃和50℃金屬浴的條件下，DOX/IR-780溫敏脂質(zhì)體(DOX/IR-780 Temperature-Sensit

8、ive-Liposomes，DITSL)在37℃時(shí)脂質(zhì)體釋藥緩慢，而在42℃和50℃藥物迅速釋放。同時(shí)，DITSL在沒有激光輻照的條件下，5分鐘的DOX累積釋放率為8.9％。而在激光輻照的條件下，DOX迅速從DITSL釋放，局部藥物濃度隨之增高。DTSL由于無IR-780，在激光輻照下藥物釋放緩慢。說明了DITSL在聯(lián)合治療中具有良好的激光可控性及溫度敏感性。
　　結(jié)論:
　　DITSL具有合適的粒徑大小、較高的藥物包封率和

9、很好的光熱轉(zhuǎn)化效率。同時(shí)DITSL具有對溫度敏感的特性，其藥物釋放可被光熱治療控制，適宜用于乳腺癌的光熱-化療聯(lián)合治療（熱化療）。
　　第二章:載DOX/IR-780脂質(zhì)體熱化療治療乳腺癌的體外實(shí)驗(yàn)
　　目的:
　　探討激光輻照下DOX/IR-780脂質(zhì)體對乳腺癌細(xì)胞的影響。
　　方法:
　　一、主要試驗(yàn)材料
　　實(shí)驗(yàn)材料:磷脂(DPPC，MPPC，DSPE-PEG2000);阿霉素;IR-780碘化

10、物;細(xì)胞活性檢測試劑盒;凋亡試劑盒;DAPI染料;細(xì)胞培養(yǎng)基;胎牛血清;胰酶;乳腺癌4T1細(xì)胞。
　　實(shí)驗(yàn)儀器:FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀;Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡;多功能酶標(biāo)儀。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　通過FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測4T1細(xì)胞在孵育不同濃度的DITSL條件下，細(xì)胞對藥物的攝取情況，并采用激光共聚焦顯微鏡對藥物在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。采用CCK-8方法檢測4T1細(xì)胞在

11、不同激光輻照強(qiáng)度(0.6W/cm2;0.8W/cm2)下的存活率，通過對凋亡細(xì)胞染色直接觀察4T1細(xì)胞在化療-光熱聯(lián)合治療后的凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.4T1細(xì)胞對DITSL、DTSL及ITSL的攝取有一定的劑量和時(shí)間依賴性。激光共聚焦顯示4T1細(xì)胞在吞噬DITSL后，脂質(zhì)體破壞后釋放的DOX富集在腫瘤細(xì)胞核，而IR-780富集在細(xì)胞質(zhì)中。
　　2.激光和高溫可以促進(jìn)DITSL在4T1細(xì)胞內(nèi)的藥物釋放。
　

12、　3.與空白對照組相比，溫敏脂質(zhì)體載體及ITSL處理組細(xì)胞活性無明顯差別，而單純化療組與單純熱療組細(xì)胞活性分別下降了40.6％和56.4％。在化療和熱療聯(lián)合治療后，細(xì)胞存活率只有19.7％，遠(yuǎn)低于其他各組。加強(qiáng)激光強(qiáng)度后，單純熱療組及聯(lián)合治療組細(xì)胞活性進(jìn)一步降低。
　　4.與空白對照組相比，熱化療可明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡/壞死，細(xì)胞凋亡/壞死情況與細(xì)胞活性情況一致。
　　結(jié)論:
　　熱療聯(lián)合化療可明顯抑制4T1乳腺癌腫瘤

13、細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡/死亡。
　　第三章:載DOX/IR-780脂質(zhì)體熱化療對乳腺癌抑制效應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　目的:
　　探討DOX/IR-780脂質(zhì)體熱化療對乳腺癌移植瘤的作用。
　　方法:
　　一、主要試驗(yàn)材料
　　實(shí)驗(yàn)材料:磷脂(DSPC，DPPC，MPPC，DSPE-PEG2000);阿霉素;IR-780碘化物;細(xì)胞培養(yǎng)基;胎牛血清;胰酶;乳腺癌4T1細(xì)胞;兔抗鼠CD31單克隆抗體單步法

14、測凋亡（TUNEL）檢測試劑盒;DBA kit;蘇木精染色液;伊紅染色液。雌性SPF級BALB/c小鼠，鼠齡8～10周齡，體重18～22g，由廣東省動(dòng)物中心提供(SCXY[粵]2013-0002)，飼養(yǎng)在中科院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院SPF級實(shí)驗(yàn)室。
　　實(shí)驗(yàn)儀器:CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱;超凈工作臺;離心機(jī);普通光學(xué)顯微鏡;倒置熒光顯微鏡;石蠟切片機(jī);正置顯微鏡;Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡;紅外熱像儀。
　　方法:用BA

15、LB/c小鼠建立4T1乳腺癌皮下移植瘤模型，隨機(jī)將荷瘤小鼠分為(1)對照組;(2)激光組;(3)化療組;(4) IR-780脂質(zhì)體組;(5)光熱治療組;(6) DOX/IR-780脂質(zhì)體組及(7)聯(lián)合治療組。各組處理后觀察小鼠腫瘤體積和體重的變化情況，記錄分析小鼠生存率，研究DOX/IR-780熱化療體內(nèi)治療效果。腫瘤組織經(jīng)H&E染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化和TUNEL免疫組化檢測組織凋亡情況。同時(shí)，各組在治療后，采用超聲造影對基于DITSL

16、的乳腺癌熱化治療的療效進(jìn)行評價(jià)，并采用B超成像檢測腫瘤內(nèi)部回聲的變化。應(yīng)用CD31免疫組織化學(xué)染色檢測乳腺腫瘤中新生微血管密度及血管的分布情況。
　　結(jié)果:
　　1.以腫瘤切片H&E染色和TUNEL檢測來評價(jià)小鼠治療后短期療效，H&E染色結(jié)果可見在熱化療后，小鼠腫瘤組織大部分細(xì)胞的細(xì)胞核已不見，細(xì)胞壞死顯著增多。而TUNEL結(jié)果也顯示在熱化療后，腫瘤組織細(xì)胞凋亡增加。
　　2.長期來看，單獨(dú)化療或光熱治療后，小鼠腫瘤體

17、積縮小，腫瘤生長受到抑制，而聯(lián)合治療之后，小鼠腫瘤較各組體積縮小明顯(P＜0.01)。小鼠在熱化療30天的生存率為100％，而PBS的30天生存率為0％。
　　3.處理48h后，超聲造影顯示熱化療組的腫瘤區(qū)域血流灌注減少。治療48h后的超聲成像顯示熱化療組腫瘤體積縮小，回聲減低。
　　4.CD31免疫熒光染色結(jié)果表明，腫瘤組織在DITSL脂質(zhì)體熱化療后，CD31陽性細(xì)胞明顯減少，與超聲造影結(jié)果一致。
　　結(jié)論: