表皮生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)的乳腺癌靶向性基因治療導(dǎo)入系統(tǒng)研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前，手術(shù)、放射治療、化療及中醫(yī)藥等綜合治療取得了很大進(jìn)展，但效果仍不理想。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的飛速發(fā)展，腫瘤基因治療將成為除手術(shù)，放療和化療等傳統(tǒng)方法外又一新的抗癌策略；尤其將在傳統(tǒng)治療手段效果較差的腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)方面將起重要作用?；蛑委熤两裆形闯蔀榕R床常規(guī)治療措施，其關(guān)鍵原因之一就是缺乏高效靶向基因?qū)胼d體。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）由于在乳腺癌中有高表達(dá)，而在正常乳腺組織中表達(dá)水平較低

2、，因此是一個(gè)很好的靶點(diǎn)。本研究旨在建立一種靶向EGFR受體的基因?qū)胂到y(tǒng)并檢驗(yàn)其有效性，為乳腺癌的靶向性基因治療提供可靠的理論依據(jù)與實(shí)踐指導(dǎo)。 通過表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）介導(dǎo)增加癌細(xì)胞對(duì)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）偶聯(lián)納米載體所載的藥物、抗體、基因等的攝取，提高所載藥物、抗體、基因等的靶向性。本課題研究制備高穩(wěn)定性和高靶向性的納米載體，并荷載靶向基因，在腫瘤的診斷治療中，以達(dá)到更好的靶向性。 方法： 1.BSA納米

3、載體與EGF偶聯(lián)BSA納米載體的制備及放射性核素的標(biāo)記及鑒定 采用二次超聲乳化技術(shù)和溶劑揮發(fā)技術(shù)制備牛血清白蛋白納米載體（bovine serum albumin nano-carrier，BSA nano-carrier），采用激光粒徑儀測(cè)定納米粒的粒徑和分布，用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)。采取Iodogen將131I標(biāo)記上BSA nano-carrier，再用Sephadex G25柱層析進(jìn)行純化，硅膠薄層層析測(cè)定標(biāo)記率、比活

4、度及放射化學(xué)純度。分別測(cè)定131I-BSA nano-carrier室溫和與新鮮人血清37℃孵育后放射化學(xué)純度的變化，了解其在室溫和血清中的穩(wěn)定性。 采用化學(xué)方法連接BSA nano-carrier與EGF，測(cè)定連接后的粒徑及粒徑分布，Sephadex G50分離純化EGF-BSA nano-carrier。聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定EGF-BSA nano-carrier的連接情況，用131I標(biāo)記EGF測(cè)定EGF-BSA nan

5、o-carrier上EGF的偶聯(lián)量。 2.131I-EGF-BSA靶向納米載體導(dǎo)入荷乳腺癌裸鼠的體內(nèi)分布 分別比較131I標(biāo)記EGF偶聯(lián)BSA納米載體，BSA納米載體和BSA（非納米載體）在乳腺癌SK-BR3細(xì)胞導(dǎo)入裸鼠的體內(nèi)分布。通過統(tǒng)計(jì)分析比較各器官的瘤/血比值和瘤/肌肉比值。 3.表皮生長(zhǎng)因子受體靶向納米載體荷載c-erbB2反義寡脫氧核苷酸對(duì)人乳腺癌SK-BR3細(xì)胞的攝取與滯留 采取氯胺T法將13

6、1I標(biāo)記c-erbB2反義寡脫氧核苷酸（Antisense oligodeoxynucleotide，ASODN），采用包裹法對(duì)131I標(biāo)記ASODN進(jìn)行EGF偶聯(lián)納米載體包載。分別測(cè)量荷131I標(biāo)記ASODN nano-carrier和131I-ASODN在人乳腺癌SK-BR3細(xì)胞的攝取率和滯留率及在荷人乳腺癌裸鼠的體內(nèi)分布，并統(tǒng)計(jì)分析荷131I標(biāo)記ASODN靶向納米載體與131I標(biāo)記ASODN在體內(nèi)各器官的分布及瘤/血比值和瘤/肌肉

7、比值。 結(jié)果： 1.BSA納米載體與EGF偶聯(lián)BSA納米載體的制備及放射性核素的標(biāo)記及鑒定 1.1, BSA納米載體的制備及鑒定 用透射電鏡進(jìn)行觀察，納米載體的形態(tài)圓整，大小粒徑較均勻。采用激光散射法測(cè)定的BSANP平均粒徑為34nm，90％的粒徑小于38nm。 131I-BSANP的131I標(biāo)記率為92.3％±3.9％，比活度為（3.1±0.7）MBq/μg。Sephadex G25分離純化得到

8、的第1放射峰即為131I-BSANP，經(jīng)24h穩(wěn)定性分析，其放射化學(xué)純度略有降低，但24h均值大于80％。與新鮮人血清37℃孵育分析其穩(wěn)定性，經(jīng)紙層析分析測(cè)得放射化學(xué)純度4h比1h略有降低，但4h均值大于85％。 -20℃保存1d后BSANP的131I標(biāo)記率為（89.7±6.4）％，15d為（86.2±5.7）％，30d為（84.3±5.2）％，90d后為（81.2±5.5）％。 1.2, EGF偶聯(lián)BSA納米載體的制備

9、及鑒定 SDS-PAGE電泳顯示，BSA nano-carrier樣品電泳條帶與Marker68kU接近，而EGF-BSA nano-carrier樣品電泳條帶與Marker75kU接近。 加入5組不同量的EGF與BSA nano-carrier的偶聯(lián)率為92.3％～98.9％。室溫穩(wěn)定性測(cè)定，在1h、6h、12h和24h同一時(shí)間點(diǎn)，組內(nèi)無顯著性（P>0.05），同組在24h內(nèi)放化純度差異有顯著意義（P<0.05），做

10、回歸分析，F(xiàn)值為30.46時(shí)間與放射純度呈線性相關(guān)，回歸方程為Y=99.37-3.451X，R2為0.942，n=3。結(jié)果顯示，131I-EGF-BSAnano-carrier在中性pH溶液中，室溫24h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，131I不易脫落。血清穩(wěn)定性，在1h、6h、12h和24h同一時(shí)間點(diǎn)，組內(nèi)無顯著性（P>0.05），在24h內(nèi)放化純度差異有顯著意義（P<0.05），做回歸分析F值為87.98時(shí)間與放射純度呈線性相關(guān)，回歸方程為Y=

11、99.86-4.156X，R2為0.981，n=3。結(jié)果顯示，131I-EGF-BSA nano-carrier在血清中，24h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，131I不易脫落。 2.131I標(biāo)記EGF偶聯(lián)BSA靶向納米載體在荷乳腺癌裸鼠的體內(nèi)分布 131I標(biāo)記EGF偶聯(lián)BSA靶向納米載體的放射性瘤/血比值和瘤/肌肉比值逐漸升高，在2h達(dá)峰值，后略有下降。131I-BSA nano-carrier放射性的瘤/血比值和瘤/肌肉比值升降

12、趨勢(shì)與131I標(biāo)記EGF偶聯(lián)BSAnano-carrier相似，但同一時(shí)間點(diǎn)的放射性瘤/血比值和瘤/肌肉比值均相對(duì)較低。將131I標(biāo)記EGF偶聯(lián)BSA nano-carrier，131I標(biāo)記BSA納米載體和131I-BSA（非納米）的瘤/血比值做方差分析：各藥物組間均方MS=3.203，F(xiàn)=14.86，R2=0.725，p<0.01，三種藥物的瘤/血比值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。三種藥物瘤/肌肉比值做方差分析：各藥物組間均方MS=15.814，F(xiàn)=

13、6.443，R2=0.403，p=0.005，p<0.01，三種藥物的瘤/肌肉比值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 131I-EGF-BSA nano-carrier對(duì)裸鼠體內(nèi)的人乳腺癌SK-BR3腫瘤具有較好的靶向性，而在肝，脾，肺等正常組織器官的分布較少，表明新的納米載體靶向性較好，而且毒副作用較低。 3.表皮生長(zhǎng)因子受體靶向納米載體荷載c-erbB2反義寡脫氧核苷酸對(duì)人乳腺癌SK-BR3細(xì)胞的攝取與滯留 c-erbB2反義

14、寡脫氧核苷酸（c-erbB2 antisense oligodeoxynucleotide，c-erbB2 ASODN以下簡(jiǎn)稱ASODN）聯(lián)合EGF偶聯(lián)BSA nano-carrier與ASODN組的放射性瘤/血比值和瘤/肌肉比值升降趨勢(shì)相似，但同一時(shí)間點(diǎn)，ASODN組的放射性瘤/血比值和瘤/肌肉比值均相對(duì)較低。將ASODN聯(lián)合EGF-BSA nano-carrier靶向納米載體與ASODN組放射性的瘤/血比值做t檢驗(yàn)：Levene's

15、方差齊性檢驗(yàn)：F=67.207，方差齊，t=5.092，p<0.05，差異有顯著性。將ASODN聯(lián)合EGF偶聯(lián)BSA nano-carrier靶向納米載體與ASODN組的放射性瘤/肌肉比值做t檢驗(yàn)：Levene's方差齊性檢驗(yàn)：F=32.92，方差齊，t=9.477，p<0.01，差異有顯著性。ASODN聯(lián)合EGF-BSA nano-carrier靶向納米載體組較ASODN組的瘤/血比值和瘤/肌肉比值高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：由