轉運siRNA的HER2靶向PEG化凍干免疫脂質體的制劑學研究.pdf

1、人類的許多疾病都與基因的過度表達相關，RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA引發(fā)的轉錄后基因沉默機制，通過RNA干擾技術沉默相關基因的表達可以治療包括腫瘤在內的許多疾病[1]。腫瘤的基因治療目前面臨的一個非常重要問題是如何將小干擾RNA（siRNA）高效地轉染入腫瘤細胞并有效發(fā)揮基因沉默效率。siRNA較易降解，而且由于細胞膜同性電荷排斥作用和腎過濾作用，使得siRNA必須借助載體運輸才能有效的轉染入腫瘤

2、細胞內；雖然載體能提高siRNA的穩(wěn)定性和轉染效率，然而siRNA/載體復合物仍然面臨網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)（RES）吞噬、從血管中外滲進入腫瘤組織、穿過腫瘤細胞膜、siRNA內涵體釋放等一系列障礙和問題[2-5]。聚乙二醇（PEG）化免疫脂質體作為一種安全有效的siRNA載體，對于上述問題的解決極具潛力。
　　 課題組前期[6]對DC-Chol/DOPE陽離子脂質體的制劑學研究已經(jīng)得出一系列結果：對于DC-Chol/DOPE陽離子脂質體

3、來說，在DC-Chol/DOPE摩爾比例為1時，siRNA的轉染效率最高，隨著DC-Chol/DOPE陽離子脂質體中的PEG含量的增加，siRNA的轉染效率呈下降趨勢。本課題正是基于前期研究結果而開展的。本研究繼續(xù)對DC-Chol/DOPE陽離子脂質體進行PEG化修飾、抗HER2單克隆抗體Fab’片段（Anti-HER2 Fab’）的靶向修飾、冷凍干燥等處理，旨在得到一種對siRNA保護性更強、腫瘤靶向性更好、內涵體釋放更多、基因沉默效

4、率更高的siRNA載體。首先，我們制備得到PEG化的DC-Chol/DOPE陽離子脂質體（簡稱PL），然后修飾Anti-HER2Fab’得PEG化的免疫脂質體（簡稱PIL），最后通過凍干制得PEG化凍干免疫脂質體（簡稱LPIL），最后，我們對PIL、LPIL及其siRNA復合物進行一系列的制劑學研究和體外活性研究。
　　 本文主要對PIL，和LPIL的粒徑、zeta電位、Fab’連接效率、siRNA包封率、siRNA血清穩(wěn)定性等

5、指標進行考察。不同PEG化的PIL，或PL的粒徑均為130～150 nm，不同PEG化的LPIL水化后粒徑增大10～20 nm。當DC-Chol/siRNA（w/w）的比例為5/1左右時，脂質體（包括PL、PIL、LPL，和LPIL）/siRNA復合物的粒徑達到峰值；在該比例為10/1時，脂質體/siRNA復合物zeta電位出現(xiàn)拐點。SDS-PAGE證實了Anti-HER2 Fab’確實連接在LPIL上，連接效率約為20％。我們利用Qu

6、ant-iTTMRiboGreen（）法測定了PIL和LPIL的siRNA包封率，結果顯示當DC-Chol/siRNA的質量比較?。?或5）時，2.5 mol％PEG的LPIL的包封率明顯高于2.5％PEG的PIL（P<0.01）。瓊脂糖凝膠電泳證實：2.5 mol％PEG的LPIL或LPL對siRNA的保護較PIL和PL好。
　　 在體外實驗中，我們對LPIL的靶向性、不同PEG化程度對LPIL的基因沉默效率影響以及2.5 m

7、ol％PEG的LPIL的體外活性進行研究。共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察結果表明：LPIL能特異性靶向高表達HER2抗原的SK-BR-3乳腺癌細胞并被內吞：流式細胞儀（FCM）結果證實凍干能顯著提高脂質體的基因沉默效率，而且含2.5mol％PEG的LPIL具有最佳的基因沉默效率；最后我們利用2.5 mol％PEG的LPIL轉導與腫瘤細胞遷移有關的Anti-RhoA siRNA，結果表明2.5 mol％PEG的LPIL能特異性沉默SK-BR