轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA的肝靶向復(fù)合載體GA-PEG-PKAE-GO的研究.pdf

1、目的：
　　肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害健康。近年來(lái)，在傳統(tǒng)的放療、化療、手術(shù)治療之外，又出現(xiàn)了以RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)為治療手段的基因治療。RNAi需要載體將作為藥物的小干擾RNA（small interfering RNA， siRNA）轉(zhuǎn)入細(xì)胞，該過(guò)程稱為轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染需要載體才能進(jìn)行。以病毒為載體遞送siRNA轉(zhuǎn)染效率高，但存在免疫原性、致癌性等弊端；非病毒載體具有低毒性、低免疫原

2、性、低致癌性、易制備、便于大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)，但是轉(zhuǎn)染效率要明顯低于病毒載體，因此提高非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率是基因治療的關(guān)鍵和基礎(chǔ)，成為目前的研究熱點(diǎn)。
　　方法：
　　本研究以氧化石墨烯為主體，制備了一種復(fù)合靶向siRNA載體GA-PEG-PKAE-GO，其中GO（graphene oxide，氧化石墨烯）為載體的主體結(jié)構(gòu)；GA（glycyrrhetinic acid，甘草次酸）為肝靶向配體；PEG（polyethylene

3、glycol，聚乙二醇）可提高復(fù)合物的血液循環(huán)時(shí)間；PKAE是一種高分子聚合物，能夠以靜電作用與siRNA結(jié)合，末端的芘基（pyrene group）可與GO通過(guò)π-π堆積結(jié)合。本研究也對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA的功能進(jìn)行了體內(nèi)外評(píng)價(jià)。
　　1.2，2-二甲氧基丙烷與2-丙烯酸羥乙酯發(fā)生縮酮交換反應(yīng)，得到KDA， KDA與二亞乙基三胺發(fā)生氮雜邁克爾加成反應(yīng)，生成 PKAE；用酸堿滴定法測(cè)定 PKAE的緩沖能力；用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定PKAE

4、在體外結(jié)合/釋放siRNA的能力。
　　2.通過(guò)EDC/NHS反應(yīng)先后合成GA-PEG與GA-PEG-GO，PKAE與GA-PEG-GO通過(guò)π-π堆積作用非共價(jià)結(jié)合；測(cè)定GA-PEG-PKAE-GO的粒徑、ζ-電位與多分散系數(shù)，考察GA-PEG-PKAE-GO的光熱效應(yīng)以及體外結(jié)合/釋放siRNA的能力。
　　3.以人肝癌細(xì)胞系 HepG2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：采用 MTT法測(cè)定 GA-PEG-PKAE-GO的細(xì)胞毒性；

5、以FAM標(biāo)記的siRNA為熒光標(biāo)記，測(cè)定復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率；采用鈣黃綠素和LysoTracker Red雙染法考察復(fù)合物的內(nèi)吞體逃逸和siRNA的釋放；用GA-PEG-PKAE-GO遞送Bcl-2 siRNA，通過(guò)RT-PCR測(cè)定Bcl-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄，并且通過(guò)Western Blotting法測(cè)定Bcl-2蛋白質(zhì)的翻譯，考察siRNA的基因沉默功效；采用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞毒性，并在Annexin V/PI雙染色的基礎(chǔ)上，觀察該復(fù)合載

6、體的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能。
　　4.裸鼠體內(nèi)植入人肝癌細(xì)胞HepG2，以多柔比星為熒光標(biāo)記，給予裸鼠GA-PEG-PKAE-GO/多柔比星復(fù)合物，通過(guò)熒光分光光度法測(cè)定多柔比星在不同器官中的分布，考察復(fù)合靶向載體GA-PEG-PKAE-GO在不同器官組織中的分布狀況。
　　結(jié)果：
　　1.合成了高分子聚合物PKAE；它在pH7.4條件下可以結(jié)合siRNA，在pH5.4的酸性環(huán)境下能水解成小分子，釋放siRNA。
　　

7、2.合成了復(fù)合靶向載體 GA-PEG-PKAE-GO，其粒徑為(266.1±101.8) nm，PDI為0.380，ζ-電位為(46.9±7.96) mV；在波長(zhǎng)為808 nm、功率為0.25W的近紅外線照射下，5分鐘使液體溫度上升3.8℃，顯著高于對(duì)照組；它在pH7.4條件下可以結(jié)合siRNA，在pH5.4的酸性環(huán)境下，與siRNA結(jié)合的PKAE模塊能水解成小分子，釋放siRNA。
　　3. MTT實(shí)驗(yàn)表明，給予復(fù)合靶向載體 G

8、A-PEG-PKAE-GO的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力與對(duì)照組沒有顯著的差異。轉(zhuǎn)染效率試驗(yàn)顯示，GA-PEG-PKAE-GO可以將FAM-siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞，GA-PEG-PKAE-GO組的熒光強(qiáng)度以及發(fā)射熒光的細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組（Lipofectamine2000），808 nm近紅外激光照射的GA-PEG-PKAE-GO組的熒光強(qiáng)度以及發(fā)射熒光的細(xì)胞數(shù)量高于GA-PEG-PKAE-GO組。內(nèi)吞體逃逸試驗(yàn)顯示，GA-PEG-PKAE-GO

9、所攜帶的siRNA發(fā)射的綠熒光與Lyso-Tracker Red所標(biāo)記的內(nèi)吞體/溶酶體發(fā)射的紅色熒光基本重合；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光在胞內(nèi)擴(kuò)散，表明GA-PEG-PKAE-GO在內(nèi)吞體中酸性環(huán)境下打破了內(nèi)吞體并將siRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中。RT-PCR實(shí)驗(yàn)和Western Blotting實(shí)驗(yàn)分別顯示，在轉(zhuǎn)染Bcl-2 siRNA之后，mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和Bcl-2蛋白質(zhì)翻譯水平明顯降低。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，在轉(zhuǎn)染Bcl-

10、2 siRNA之后，HepG2細(xì)胞的活力顯著下降。流式細(xì)胞分析顯示，在轉(zhuǎn)染Bcl-2 siRNA之后，HepG2細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡。
　　4.組織分布實(shí)驗(yàn)顯示，復(fù)合靶向載體GA-PEG-PKAE-GO在裸鼠肝臟和腫瘤組織中的分布顯著超過(guò)其他器官。
　　結(jié)論：
　　復(fù)合靶向載體GA-PEG-PKAE-GO能夠在體內(nèi)靶向運(yùn)輸siRNA，順利地轉(zhuǎn)染siRNA，在胞內(nèi)釋放siRNA，并且保證siRNA在胞內(nèi)發(fā)揮作用，具有較好