DCs靶向溫敏性siRNA納米載體的體外評價.pdf

1、目的：利用siRNA干擾技術(shù)抑制樹突狀細胞中凋亡基因Bak的表達，在細胞水平上進行了siRNA抑制效果的評估。但是，siRNA的給藥系統(tǒng)方面尚存不足，如靶向性低，轉(zhuǎn)染率低和體內(nèi)不穩(wěn)定等因素。所以，設(shè)計有效負載靶向DCs中Bak基因的siRNA藥物載體系統(tǒng)，對提高DCs的抗原提呈能力、促進免疫應(yīng)答和增強抗腫瘤作用均具有非常積極的意義。本文基于DCs表面特異性表達的DEC-205受體，制備了負載siRNA的DEC-205抗體修飾的溫度敏感性

2、納米膠束，并對其制劑學(xué)特征、細胞毒性、靶向性、攝取率、攝取機制、siRNA的內(nèi)涵體逃逸及沉默效率和DCs存活率等方面進行評價，為構(gòu)筑安全有效的抗腫瘤siRNA疫苗載體系統(tǒng)提供理論依據(jù)。
　　方法：首先，在前期研究的基礎(chǔ)上，合成并表征了 DEC-205修飾的溫度敏感性泊洛沙姆接枝殼聚糖聚合物（DEC-205-Po-CS），并對該聚合物納米膠束的粒徑、Zeta電位、包封率、溫敏性、穩(wěn)定性和細胞毒性進行了評價。其次，體外分離小鼠骨髓中單

3、個核細胞，利用細胞因子誘導(dǎo)分化獲得DCs，以Lipofectamine2000作為對照，通過流式細胞儀考察了DCs對負載FAM-siRNA的DEC-205-Po-CS納米膠束的攝取率。原子力顯微鏡觀察 DCs對納米膠束的內(nèi)吞作用，利用內(nèi)吞抑制劑進一步闡釋內(nèi)吞的具體路徑，熒光顯微鏡觀察冷休克對細胞內(nèi)涵體形態(tài)的影響。最后，利用Western Blot和 RT-PCR評價了 Bak基因沉默效率，并采用凋亡試劑盒測定了轉(zhuǎn)染負載沉默 Bak的si

4、RNA納米膠束后DCs的存活率。
　　結(jié)果：紅外光譜、核磁共振圖譜及熱重分析結(jié)果證實了泊洛沙姆接枝殼聚糖聚合物的合成，其 CMC值為（1.20±0.10）×10-6 mol·L-1。制備的載藥納米膠束粒徑為（230.9±3.9）nm，Zeta-電位為+（14.57±1.12）mV，包封率為（85.6±2.37）%，重現(xiàn)性均良好。流式細胞儀檢測表明DEC-205修飾納米膠束可提高DCs的攝取率。原子力顯微鏡觀察 DCs通過內(nèi)吞作用攝

5、取納米膠束，主要是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞，少部分是小窩蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞，并且是一個消耗能量的內(nèi)吞過程。熒光顯微鏡觀察冷休克后溫敏性納米載體膨脹，導(dǎo)致內(nèi)涵體破裂，實現(xiàn)siRNA從內(nèi)涵體逃逸。Western Blot結(jié)果證明，負載siRNA的DEC-205-Po-CS納米膠束轉(zhuǎn)染imDCs3 h后進行冷休克，并且冷休克的時間為15 min時，蛋白的表達量較低，蛋白表達抑制率為（81.81±6.89）%；RT-PCR結(jié)果表明，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染組；D

6、EC-205-Po-CS轉(zhuǎn)染組；DEC-205-Po-CS轉(zhuǎn)染加冷休克組對DC細胞Bak基因有明顯的抑制作用，均能顯著下調(diào)Bak mRNA的表達。流式細胞儀檢測 DCs凋亡結(jié)果，DEC-205-Po-CS加冷休克組 DCs存活率（73.62±3.93）%，明顯高于對照組（28.89±3.09）%和脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染組（42.84±2.53）%。
　　結(jié)論：本文制備了溫度敏感性 DEC-205修飾的泊洛沙姆接枝殼聚糖聚合物納米膠束，