磁性納米藥物靶向治療腫瘤的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：阿霉素（Adriamycin，ADR或Doxorubicin，DOX）是一種蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥，具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，可廣泛應(yīng)用于治療骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌及晚期乳腺癌。但在化療過程中，阿霉素對(duì)腫瘤組織特異性較差，可引起劑量限制性毒性。而且腫瘤細(xì)胞也可對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生抗藥性。這些問題一直限制著其在腫瘤治療中的應(yīng)用.為了解決這些問題，近幾十年來的研究主要集中于研發(fā)腫瘤特異性藥物及載體系統(tǒng)，可將抗腫瘤藥物選擇性地集中釋放到

2、腫瘤部位。納米技術(shù)的進(jìn)步為腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展提供了廣闊的發(fā)展前景。納米靶向給藥一般采用兩種形式，即被動(dòng)靶向及主動(dòng)靶向。被動(dòng)靶向通過腫瘤組織血管的高通透性和不連續(xù)性導(dǎo)致納米顆粒滲漏到血管外腫瘤組織及腫瘤限制淋巴引流系統(tǒng)這兩種途徑，實(shí)現(xiàn)納米顆粒在腫瘤組織的選擇性聚集，稱為增強(qiáng)的透過及滯留（EPR）效應(yīng)。主動(dòng)靶向主要利用腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的特異性抗原表位和受體作為靶點(diǎn)，或通過納米顆粒的某種物理性質(zhì)（如對(duì)溫度、酸堿度、電荷、光、聲或

3、磁場(chǎng)的靈敏度）實(shí)現(xiàn)其靶向作用。納米顆粒作為靶向給藥系統(tǒng)具有下列顯著優(yōu)勢(shì)：（1）能夠?qū)崿F(xiàn)多重靶向機(jī)制，增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤組織的特異性及選擇性；（2）降低達(dá)到靶區(qū)特定濃度所需的藥物劑量；（3）降低正常組織的藥物濃度，減輕毒副作用；（4）通過胞吞作用或吞噬作用可在細(xì)胞水平發(fā)揮藥效；（5）可以構(gòu)建多功能納米顆粒，集腫瘤顯像、靶向化療、熱療、放療于一體.
　　 研究目的：本課題的目的是構(gòu)建一種多重靶向的納米給藥系統(tǒng)-偶聯(lián)單克隆抗體的載阿霉素磁

4、性納米顆粒，在外部磁場(chǎng)、抗體靶向及納米顆粒被動(dòng)靶向共同作用下，能選擇性地將阿霉素釋放到腫瘤組織，降低用藥劑量及毒副作用。本階段的研究?jī)?nèi)容主要包括兩方面：（1）體外研究?jī)煞N不同粒徑的載阿霉素的磁性納米顆粒的細(xì)胞毒性；（2）制備、純化并鑒定抗人骨肉瘤OS-732細(xì)胞株的單克隆抗體。
　　 研究方法：（1）本實(shí)驗(yàn)中采用兩種不同粒徑的載阿霉素的磁性納米顆粒：Fe3O4-DEX-DOX及Fe3O4-PLGA-DOx，以比較它們對(duì)細(xì)胞的毒性

5、；Hoechst33258染色，熒光顯微鏡觀察其被細(xì)胞攝取及在細(xì)胞內(nèi)分布的情況；MTT法檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用；LDH釋放法測(cè)定其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用；Annexin V-FITC/PI雙熒光染色，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)其促腫瘤細(xì)胞凋亡/壞死的作用。（2）利用雜交瘤細(xì)胞誘生腹水制備單克隆抗體，Protein A Sepharose CL-4B親和層析法純化單克隆抗體，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、免疫組化染色及酶聯(lián)免

6、疫特異性測(cè)定（ELISA）法鑒定其性質(zhì)。
　　 研究結(jié)果：（1）熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，載阿霉素磁性納米顆?？蛇x擇性地大量進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并可進(jìn)入細(xì)胞核，卻很少進(jìn)入正常人胚肺細(xì)胞。（2）載阿霉素磁性納米顆粒具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的作用。（3）Annexin V-FITC/PI雙熒光染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，載阿霉素的磁性納米顆粒促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死，壞死率高于單純阿霉素，隨濃度增高及時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡率下降，壞死率增高。（4）MTT檢

7、測(cè)結(jié)果顯示，載阿霉素磁性納米顆粒抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用強(qiáng)于單純阿霉素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。（5）LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，載阿霉素的磁性納米顆粒組釋放LDH顯著高于單純阿霉素組（p<0.05）。（6）載阿霉素磁性納米顆粒易被單核巨噬細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞攝取，提示給藥途徑應(yīng)盡量避免與血液循環(huán)系統(tǒng)接觸。（7）純化的單克隆抗體對(duì)人骨肉瘤、軟骨肉瘤、脂肪肉瘤、尤文氏肉瘤及惡性纖維組織細(xì)胞瘤等骨科惡性腫瘤的組織切片免疫組化染色陽性，SD