肝靶向免疫基因載體的研究.pdf

1、本研究開發(fā)了一種新型的非病毒基因傳遞系統(tǒng)。通過利用多聚陽離子PEI壓縮質粒DNA,然后用PEG化的脂質體包裹PEI/pDNA壓縮體,形成脂質復合載體LPD,并將人胰島素受體的單克隆抗體(8314-SA)與脂質中的DSPE-PEG2000-biotin中的生物素基團(biotin)共軛,形成以單克隆抗體(MAb)為靶向基團的復合載體(8314-LPD),MAb提高了復合載體的靶向能力。8314-LPD是一種肝主動靶向四元長循環(huán)基因載體制劑

2、。其具體研究內容及結果如下:
　　 首先用轉化的大腸桿菌擴增含有報告基因的質粒DNA(PEGFP-C1),再用QIAGEN無內毒素大提試劑盒提取質粒DNA,并對其濃度和質量進行評定。然后分別制備出PEG化的脂質體(脂質處方為POPC94％,DDAB2％,DSPE-PEG20003％和DSPE-PEG2000-biotin1％)和PEI/pDNA聚陽離子壓縮體,用所得脂質體包裹PEI/pDNA壓縮體形成了LPD復合物。單因素實驗結

3、合均勻設計實驗優(yōu)化LPD處方,單因素實驗考察結果為:質粒濃度在40μg/ml以下,粒徑變化不大,濃度增大,復合物粒徑增大； N/P超過1.5時,質粒的包封完全,隨著N/P的增大,復合物粒徑減小,電位增大,在N/P等于15時,粒徑最小,再增大N/P,粒徑基本不再發(fā)生變化；脂質/pDNA的摩爾比在50:1時,酶切電泳顯示脂質可以完全包封PEI/pDNA壓縮體,隨著脂質/pDNA的比例增大,LPD的粒徑減小,電位降低,在170:1時粒徑最小,

4、脂質/pDNA的摩爾比再增大,復合物粒徑開始變大。均勻設計實驗優(yōu)化LPD復合物處方的結果為:在pH7.0的HEPES緩沖液中,質粒濃度為40μg/ml,N/P=15,脂質/pDNA=170:1時,制備的LPD平均粒徑為130 nm,平均zeta電位為1.5mV。進一步對LPD進行結構修飾,在外層脂質膜的PEG鏈上偶聯(lián)抗人胰島素受體的單克隆抗體(8314-SA),形成肝主動靶向的單克隆抗體修飾的Lipo/PEI/pDNA復合物(8314-

5、LPD)。透射電鏡下觀察,肝靶向8314-LPD復合物的近似球形,形態(tài)規(guī)整,無粘連；對其粒徑電位分析,平均粒徑在150nm左右,電位在4.5mv左右。以綠色熒光蛋白基因PEGFP-C1作為報告基因考察復合物對質粒的酶切保護能力,凝膠電泳分析實驗證明這種基因載體能有效地保護質粒DNA免受DNA酶(DNaseⅠ)降解；血清穩(wěn)定性實驗表明8314-LPD復合物可以在血清中穩(wěn)定存在；長期穩(wěn)定性實驗考察結果,4℃和25℃氮氣密封貯存,復合物粒徑都

6、有所增大,但變化幅度不同,說明溫度對復合物的穩(wěn)定性有明顯的作用,25℃貯存會使復合物粒徑在一個月內發(fā)生非常大的增大。
　　 體外的細胞轉染實驗和細胞毒性實驗分析,LPD載體的轉染效率小于PEI/pDNA壓縮體,但是經單克隆抗體修飾后,8314-LPD基因載體能夠很好的被人肝癌細胞SMMC-7721攝取,與前兩組基因載體相比,轉染率有明顯的提高。MTT實驗中顯示LPD和8314-LPD復合物的毒性都明顯小于PEI/pDNA多聚陽離

7、子壓縮體。
　　 為了提高8314-LPD復合物的長期穩(wěn)定性,通過冷凍干燥法將其制備成凍干粉針劑。具體步驟是,首先篩選優(yōu)質凍干保護劑,通過考察凍干粉的外觀,色澤,表面細化程度,再分散能力,發(fā)現(xiàn)海藻糖制備的凍干粉外觀不塌陷,不起泡,色澤均勻,質地細膩；復溶后,再分散時間短；復溶后,復合物的粒徑和Zeta電位基本沒有變化,是載體的最優(yōu)保護劑。其次,對凍干粉進行質量評價,通過對凍干粉復溶后抗酶切實驗,發(fā)現(xiàn)經凍干復溶后的制劑仍能保持抗核

8、酸酶能力,說明載體結構在凍干過程中沒有受到破壞。轉染實驗證明,經凍干復溶的載體的轉染活性也基本沒有變化。
　　 本研究結果表明,8314-LPD復合物制備方法簡單易行,能夠有效保護質粒DNA不被核酸酶降解,復合物的血清中穩(wěn)定性和細胞轉染率都比較高,細胞毒性小,并可通過冷凍干燥法制備出性質穩(wěn)定可長期保存的凍干粉針劑。這種肝主動靶向的長循環(huán)免疫基因載體,綜合利用了陽離子多聚物和脂質體的優(yōu)點,克服了二者的缺點,相信在肝癌的基因治療中,