新型細(xì)胞核靶向非病毒基因載體的研究.pdf

1、隨著生物技術(shù)與分子生物學(xué)的發(fā)展,以及人類基因組計(jì)劃的完成,基因治療已經(jīng)成為遺傳病、傳染病、癌癥等重大疾病的一種新興治療方法。有效地基因治療需要高效的傳遞載體。非病毒基因載體具有無免疫源性、低毒、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn),但是相比于病毒載體,其轉(zhuǎn)染效率低,限制了其臨床應(yīng)用。非病毒載體的基因傳遞有三個(gè)主要屏障:細(xì)胞膜、內(nèi)吞體膜、細(xì)胞核。本課題將糖皮質(zhì)激素(GC)與陽離子聚合物連接,合成新型GC-聚陽離子化合物,以糖皮質(zhì)激素作為核定位信號(hào)(NLS),增加載

2、體的細(xì)胞核靶向作用,提高轉(zhuǎn)染效率。利用糖皮質(zhì)激素的脂溶性,用GC-聚陽離子修飾脂質(zhì)體,得到新型的聚陽離子脂質(zhì)體。同時(shí)用特異性細(xì)胞配體修飾脂質(zhì)體,使其具有細(xì)胞特異性靶向和細(xì)胞核靶向的雙重作用。課題首先選擇5種具有21-羥基的糖皮質(zhì)激素,將21-羥基用甲磺?；〈?再用Traut’s試劑(2-iminothiolane)將其與低分子量聚乙烯亞胺(PEI1800)接枝,合成糖皮質(zhì)激素-聚陽離子(GC-PEI),用1H-NMR和紅外光譜驗(yàn)證GC

3、與PEI的結(jié)合。采用瓊脂糖凝膠電泳、動(dòng)態(tài)光散射、透射電鏡研究了它們與pDNA結(jié)合后粒子(polyplex)的理化性質(zhì),MTT法檢測其細(xì)胞毒性,用pEGFP-N1和pGL-3質(zhì)粒評(píng)價(jià)了其在HEK293和HepG2細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效率。將新型材料用異硫氰酸熒光素標(biāo)記,激光共聚焦顯微鏡觀察其細(xì)胞內(nèi)定位。結(jié)果表明,5種polyplex的理化性質(zhì)差別不大,細(xì)胞毒性明顯低于PEI25k,轉(zhuǎn)染效率的高低順序?yàn)?倍他米松-PEI＞地塞米松-PEI＞甲基強(qiáng)

4、的松龍-PEI＞潑尼松龍-PEI＞氫化可的松-PEI,表明新型GC-PEI的轉(zhuǎn)基因活性與取代的GC活性為正比關(guān)系,GC的活性越高,與受體結(jié)合的能力越強(qiáng),則轉(zhuǎn)染活性越高。選取活性更強(qiáng)的曲安奈德(TA),與PAMAM(G4)接枝合成PAMAM-TA以提高其轉(zhuǎn)染效率,降低毒性。為檢驗(yàn)TA取代度的影響,合成高、低取代度的PAMAM聚合物(PAMAM-TA-H的PAMAM-TA-L).研究表明,它們的理化性質(zhì)相似。MTT檢測表明其毒性顯著低于PA

5、MAM與PEI25K。細(xì)胞內(nèi)定位研究表明PAMAM定位于細(xì)胞質(zhì),而PAMAM-TA-H和PAMAM-TA-L均定位于細(xì)胞核。這表明將TA接枝PAMAM會(huì)促進(jìn)其細(xì)胞核定位,從而提高轉(zhuǎn)染效率。TA取代度低至0.22不會(huì)影響其細(xì)胞核定位能力。此外,將TA與不同分子量的PEI連接(Mw600,1800,25k),對(duì)其理化性質(zhì)、細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞內(nèi)定位進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,所得三種PEI-TA的理化性質(zhì)相似,毒性明顯低于PEI25k,轉(zhuǎn)染效

6、率大小順序?yàn)镻EI1800-TA＞ PEI600-TA＞ PEI25K-TA。用TA抑制轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明,TA會(huì)顯著抑制PEI1800-TA和PEI600-TA的轉(zhuǎn)染效率,對(duì)PEI25K-TA無影響,說明PEI1800-TA和PEI600-TA會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核而提高轉(zhuǎn)染效率,因此TA與受體結(jié)合后會(huì)抑制其轉(zhuǎn)染效率,PEI25K-TA不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核,因此不受TA影響。激光共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,小鼠肝門靜脈注射后,PEI1

7、800-TA和PEI25k/pEGFP在肝臟中有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá),而PEI1800-TA顯著高于PEI25k,這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,而在其它臟器中無表達(dá)。最后,本文將PEI1800-TA與脂質(zhì)體結(jié)合,制備聚陽離子脂質(zhì)體,再用帶有半乳糖苷基團(tuán)的[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸膽固醇酯(CHEDLA)修飾脂質(zhì)體,制備成連續(xù)靶向基因載體(STL),使其具有細(xì)胞核靶向和細(xì)胞特異性靶向功能,期望能夠有效突破各種障礙,實(shí)現(xiàn)高效的基因傳遞。通過理化性

8、質(zhì)研究,表明PEI-TA成功修飾了脂質(zhì)體,STL為納米結(jié)構(gòu),表面帶正電荷,能夠有效壓縮pDNA。STL的細(xì)胞毒性低于PEI-TA,而轉(zhuǎn)染效率高于后者。STL的組成中磷脂與PEI-TA的摩爾比為6:4,含有10％ CHEDLA時(shí),轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)。加入游離的半乳糖能夠顯著抑制STL的轉(zhuǎn)染,證明其肝細(xì)胞特異靶向性。體內(nèi)研究表明,肝門靜脈注射后,10% CHEDLA STL的肝臟表達(dá)顯著高于0%CHEDLA STL、PEI1800-TA和PEI2