配體介導的非病毒基因載體的研究.pdf

1、在過去的20年中，人工合成的陽離子脂質體和聚合物作為基因載體已被廣泛應用于腫瘤治療的研究中，然而，外源基因如何進行轉運及影響基因轉運的因素等機制問題還沒有被明確闡明。根據基因轉運的一般過程，可將阻礙基因轉運的因素分為細胞外環(huán)境屏障和細胞內屏障。要使外源基因能夠導入細胞并表達，首先，必須保證外源基因在細胞外不受破壞，不被核酸酶所降解，并有效的到達靶細胞，經細胞內吞進入溶酶體，再通過溶酶體逃逸進入胞漿，然后轉運至細胞核內進行表達。本文運用不

2、同配體對載體材料進行修飾，制備形成具有靶向或雙功能基因載體，并對載體的靶向性及基因轉染能力進行驗證。
　　 具有抗病毒、抗腫瘤、調節(jié)免疫功能和降血糖等多種生物活性的天然植物多糖受到越來越多的研究者的青睞，并已經開始運用于非病毒基因載體的研究中。本文將從薏苡仁種子中提取的薏苡仁多糖(Coixan polysaccharide，CP)與小分子量的聚乙烯亞胺(PEI1200Da)偶聯(lián)形成可攜帶DNA的聚合物載體，并用靶向配體葉酸對聚合

3、物修飾。對合成產物CP-PEI-FA進行各種表征，檢驗聚合物的DNA縮合能力，粒徑和ζ-電位、細胞毒性和轉染效率。MTT實驗證明CP-PEI-FA相對于PEI25 kDa具有非常低的毒性，與PEI1200毒性接近?；蜣D染實驗結果顯示CP-PEI-FA對葉酸受體表達陽性細胞C6和HeLa具有高的轉染效率，證明了CP-PEI-FA對葉酸受體的靶向性。值得注意的是，在體內分布實驗中CP-PEI-FA能有效的將DNA轉運至腫瘤組織并使基因表達

4、。以上結果顯示，CP-PEI-FA無論在體內和體外都顯示出非常好的基因轉染能力。
　　 細胞膜是外源基因進入細胞的第一道障礙，為了克服細胞膜屏障，本文還聯(lián)合運用靶向配體葉酸和細胞穿膜肽R8對陽離子骨架材料聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精(PEI600-CD，PC)進行修飾后，與DNA形成了雙功能復合物FA-PC/R8-PC/DNA-L，體內實驗和體外實驗結果都顯示FA-PC/R8-PC/DNA-L能在與葉酸受體陽性細胞靶向結合且更容易跨越

5、細胞膜到達胞漿內，從而提高轉染效率。
　　 最后，本文將兼具靶向和穿膜作用的短肽CC9，按照不同的摩爾比與聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精(PEI600-CD，PC)偶聯(lián)，并對合成產物PC-CC9與DNA形成的復合物進行MTT粒徑、ζ-電位和、體內和體外轉染效率的檢測。對兩種方法形成的復合物PC/DNA+CC9(CC9偶聯(lián))和PC/DNA+CC9(CC9混合)的轉染效率進行了比較，結果顯示，兩種復合物靶向性和轉染效率無顯著性差異，PC/D

6、NA+CC9較PC-CC9/DNA稍好。本文還用流式細胞儀對轉染PC-CC9/miRNA-34a.eGFP和PC/miRNA-34a.eGFP+CC9的PANC-1細胞進行細胞周期和細胞凋亡的分析檢測，檢驗miRNA-34a對腫瘤細胞生長的影響。WestenBlot和qRT-PCR實驗結果顯示PANC-1細胞轉染PC-CC9/miRNA-34a.eGFP和PC/miRNA-34a.eGFP+CC9復合物后，細胞內與BCL-2、E2F3、