配體介導(dǎo)的非病毒基因載體的研究.pdf

1、在過去的20年中，人工合成的陽離子脂質(zhì)體和聚合物作為基因載體已被廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究中，然而，外源基因如何進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)及影響基因轉(zhuǎn)運(yùn)的因素等機(jī)制問題還沒有被明確闡明。根據(jù)基因轉(zhuǎn)運(yùn)的一般過程，可將阻礙基因轉(zhuǎn)運(yùn)的因素分為細(xì)胞外環(huán)境屏障和細(xì)胞內(nèi)屏障。要使外源基因能夠?qū)爰?xì)胞并表達(dá)，首先，必須保證外源基因在細(xì)胞外不受破壞，不被核酸酶所降解，并有效的到達(dá)靶細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入溶酶體，再通過溶酶體逃逸進(jìn)入胞漿，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。本文運(yùn)用不

2、同配體對載體材料進(jìn)行修飾，制備形成具有靶向或雙功能基因載體，并對載體的靶向性及基因轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和降血糖等多種生物活性的天然植物多糖受到越來越多的研究者的青睞，并已經(jīng)開始運(yùn)用于非病毒基因載體的研究中。本文將從薏苡仁種子中提取的薏苡仁多糖(Coixan polysaccharide，CP)與小分子量的聚乙烯亞胺(PEI1200Da)偶聯(lián)形成可攜帶DNA的聚合物載體，并用靶向配體葉酸對聚合

3、物修飾。對合成產(chǎn)物CP-PEI-FA進(jìn)行各種表征，檢驗(yàn)聚合物的DNA縮合能力，粒徑和ζ-電位、細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率。MTT實(shí)驗(yàn)證明CP-PEI-FA相對于PEI25 kDa具有非常低的毒性，與PEI1200毒性接近。基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CP-PEI-FA對葉酸受體表達(dá)陽性細(xì)胞C6和HeLa具有高的轉(zhuǎn)染效率，證明了CP-PEI-FA對葉酸受體的靶向性。值得注意的是，在體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)中CP-PEI-FA能有效的將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤組織并使基因表達(dá)

4、。以上結(jié)果顯示，CP-PEI-FA無論在體內(nèi)和體外都顯示出非常好的基因轉(zhuǎn)染能力。
　　 細(xì)胞膜是外源基因進(jìn)入細(xì)胞的第一道障礙，為了克服細(xì)胞膜屏障，本文還聯(lián)合運(yùn)用靶向配體葉酸和細(xì)胞穿膜肽R8對陽離子骨架材料聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精(PEI600-CD，PC)進(jìn)行修飾后，與DNA形成了雙功能復(fù)合物FA-PC/R8-PC/DNA-L，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示FA-PC/R8-PC/DNA-L能在與葉酸受體陽性細(xì)胞靶向結(jié)合且更容易跨越

5、細(xì)胞膜到達(dá)胞漿內(nèi)，從而提高轉(zhuǎn)染效率。
　　 最后，本文將兼具靶向和穿膜作用的短肽CC9，按照不同的摩爾比與聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精(PEI600-CD，PC)偶聯(lián)，并對合成產(chǎn)物PC-CC9與DNA形成的復(fù)合物進(jìn)行MTT粒徑、ζ-電位和、體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染效率的檢測。對兩種方法形成的復(fù)合物PC/DNA+CC9(CC9偶聯(lián))和PC/DNA+CC9(CC9混合)的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，兩種復(fù)合物靶向性和轉(zhuǎn)染效率無顯著性差異，PC/D

6、NA+CC9較PC-CC9/DNA稍好。本文還用流式細(xì)胞儀對轉(zhuǎn)染PC-CC9/miRNA-34a.eGFP和PC/miRNA-34a.eGFP+CC9的PANC-1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的分析檢測，檢驗(yàn)miRNA-34a對腫瘤細(xì)胞生長的影響。WestenBlot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染PC-CC9/miRNA-34a.eGFP和PC/miRNA-34a.eGFP+CC9復(fù)合物后，細(xì)胞內(nèi)與BCL-2、E2F3、