Pluronic修飾的聚陽離子非病毒基因載體的構(gòu)建、表征及體外轉(zhuǎn)染效率評價.pdf

1、基因治療是通過載體將目的基因傳遞到特定的組織細胞（靶細胞）內(nèi)進行適當(dāng)表達以治療疾病的方式。目前基因治療的載體分為病毒型載體和非病毒型載體。非病毒載體以其靶向性、低免疫原性、低成本、易規(guī)?；炔《据d體所沒有的顯著優(yōu)而具有更好的臨床應(yīng)用前景，而在非病毒載體中，陽離子聚合物載體在基因轉(zhuǎn)移方面呈現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢。通過對陽離子非病毒載體的修飾，可以有效地屏蔽陽離子表面的正電荷，降低復(fù)合物的毒性，達到長循環(huán)的目的。
　　 目前，常用親水性的

2、材料對載體進行修飾，最常用的修飾劑是聚乙二醇（PEG），而普朗尼克（Pluronic）作為一種表面活性劑，富含親水親油基團，可以降低復(fù)合物毒性和提高對細胞的親和性，目前對Pluronic 修飾的陽離子聚合物載體研究報道較少，更沒有系統(tǒng)地評價。本課題通過對PEI、PAMAM兩種常用的載體的Pluronic修飾，考察它們的細胞毒性和轉(zhuǎn)染效率，并與PEG 化的材料做系統(tǒng)的比較，希望得到一種或者幾種優(yōu)于PEG 修飾的Pluronic 修飾的載體

3、材料，為基因遞釋系統(tǒng)的研究提供支持。
　　 本文第一部分我們對Pluronic （型號P123）的末端羥基進行了活化，使用的是琥珀酰亞胺酯法，最后得到了活化率高，反應(yīng)活度大的產(chǎn)物。使用活化后的聚合物按不同比例對PEI和PAMAM 進行修飾。經(jīng)過純化干燥處理，得到了一系列不同修飾度的聚合物（每個PEI 或PAMAM分子上分別接枝1個、2個、5個、10個PluronicP123）。同時，也合成了PEG 化的上述聚合物。1H-NMR

4、結(jié)果顯示，本方法合成的陽離子聚合物接枝率高，定量控制投藥量對PEI 或PAMAM 進行修飾，可以使其接枝率與反應(yīng)時投藥量的摩爾比呈良好的線性關(guān)系，說明該合成方法比較穩(wěn)定、可靠，產(chǎn)率高。另外，1H-NMR 圖譜分析中未見其它雜質(zhì)峰，也進一步證明這些陽離子聚合物的純度較高。
　　 本文第二部分則考察了陽離子接枝聚合物/DNA 復(fù)合物的相關(guān)性質(zhì)。從凝膠電泳阻滯分析結(jié)果可以看出，完全阻滯DNA 所需的N/P值隨著聚合物修飾度的增加而增大

5、，隨著修飾物分子量的減小而減小。粒徑結(jié)果顯示，本實驗所制備的復(fù)合物粒徑在60-300nm 范圍內(nèi)。隨著復(fù)合物N/P值的增加，粒徑有減小的趨勢。高分子量的修飾物，在高修飾度時復(fù)合物的粒徑明顯增大。復(fù)合物的zeta 電位隨N/P值的增加而增加；在相同N/P值情況下，復(fù)合物zeta 電位隨P123 或PEG 接枝數(shù)的增加而減少。
　　 第三部分評價了陽離子接枝聚合物/DNA 復(fù)合物細胞毒性以及體外轉(zhuǎn)染效果。
　　 MTT 法測

6、定了聚合物細胞毒性。結(jié)果表明，使用PEG 或P123 修飾PEI 或PAMAM 可以不同程度的降低其細胞毒性，在低濃度時每個PEI 或PAMAM 接枝一個表面活性劑的分子即可顯著降低細胞毒性，但總的來說，P123 修飾的PAMAM 毒性遠遠低于P123 修飾的PEI，從修飾基團的角度來說，P123與PEG 修飾的復(fù)合物在相同修適度的情況下，毒性相當(dāng)。選用了兩種分別編碼綠色熒光蛋白和蟲熒光素酶的質(zhì)粒。陽離子接枝聚合物/DNA 復(fù)合物在He