新型陽(yáng)離子高分子基因載體系統(tǒng)的構(gòu)建與評(píng)價(jià).pdf

1、基因治療已經(jīng)開(kāi)始用于腫瘤、癌癥及各種遺傳性疾病的治療當(dāng)中，臨床效果較傳統(tǒng)治療顯著，且應(yīng)用前景廣闊。而要實(shí)現(xiàn)高效的基因治療，設(shè)計(jì)高效低毒的基因載體是其中一個(gè)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。基因載體包括病毒類載體、非病毒類載體，相對(duì)于病毒載體，非病毒載體尤其是陽(yáng)離子非病毒載體具有低細(xì)胞毒性、低免疫性、易合成等特點(diǎn)，已成為目前的研究熱點(diǎn)。
　　殼聚糖作為天然的多糖，具有無(wú)毒，可降解，生物相容性好，且分子中含有大量的氨基，能與質(zhì)粒DNA復(fù)合形成納米粒，已有大

2、量報(bào)道將其作為基因載體應(yīng)用于基因治療。但是殼聚糖水溶性差，與DNA復(fù)合緊密而難于在體內(nèi)釋放DNA，轉(zhuǎn)染效率較低，臨床應(yīng)用受到限制。因此，尋找適合的途徑得到新型陽(yáng)離子殼聚糖衍生物來(lái)作為基因載體，提高它的轉(zhuǎn)染效率，是研究者努力的方向。本論文實(shí)驗(yàn)第一部分利用邁克爾加成反應(yīng)合成了一系列新型水溶性殼聚糖衍生物。用核磁共振氫譜對(duì)載體材料進(jìn)行化學(xué)表征，以確定其結(jié)構(gòu)。用凝膠電泳實(shí)驗(yàn)觀察殼聚糖衍生物與質(zhì)粒DNA的結(jié)合能力，用電子掃描電鏡來(lái)觀察粒子的形狀大

3、小，測(cè)定粒子粒徑及電動(dòng)電勢(shì)，用MTT法檢測(cè)復(fù)合體的細(xì)胞毒性，通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)測(cè)定殼聚糖衍生物的轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與殼聚糖相比，新型殼聚糖衍生物具有較低的細(xì)胞毒性，較好的DNA復(fù)合能力，在293 T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中有更高的轉(zhuǎn)染效率。
　　基于二硫鍵對(duì)不同濃度的谷胱甘肽濃度有特異響應(yīng)性，并且細(xì)胞中的谷胱甘肽濃度高于血液中的谷胱甘肽濃度，癌細(xì)胞中的谷胱甘肽濃度約為正常細(xì)胞內(nèi)的四倍，本論文實(shí)驗(yàn)第二部分我們以透明質(zhì)酸為骨架，引入

4、二硫鍵，后接枝四乙烯五胺制備出一種基于透明質(zhì)酸的陽(yáng)離子高分子載體，用紅外、核磁共振氫譜(1H NMR)對(duì)載體材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。通過(guò)與質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物，并用瓊脂糖凝膠電泳分析其結(jié)合 DNA的能力及在高濃度谷胱甘肽刺激下釋放 DNA的能力；測(cè)定復(fù)合粒子的粒徑、電勢(shì)，并在掃描電子顯微鏡下觀察復(fù)合物的形態(tài)；用MTT法檢測(cè)復(fù)合體的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，新合成的透明質(zhì)酸陽(yáng)離子衍生物易與 DNA復(fù)合，并在模擬細(xì)胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽刺激下釋放 DNA，