陽(yáng)離子膽固醇衍生物基因載體的構(gòu)建及評(píng)價(jià).pdf

1、近年來(lái)，基因治療在遺傳病、腫瘤治療等方面有很好的前景,引起廣泛關(guān)注?；蛑委熋媾R的瓶頸問(wèn)題是尋找一種高效、低毒的基因轉(zhuǎn)染載體,將基因藥物遞送至特定的細(xì)胞中,并能穩(wěn)定地維持其功能。目前,基因載體一般分為非病毒載體和病毒載體，而陽(yáng)離子脂質(zhì)體是非病毒載體中最具潛力的基因載體之一。
　　本論文主要考察陽(yáng)離子膽固醇衍生物的鏈接基團(tuán)和鏈長(zhǎng)對(duì)轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)染效率的影響，分別以N,N-二甲基乙二胺（DMAEA）或N,N-二甲基丙二胺(DMAPA)和膽

2、固醇甲酰氯反應(yīng)生成鏈接基團(tuán)為酯基的(N,N-二甲基氨基乙基)-氨基甲酰基]膽固醇（DC-Chol）及多一個(gè)碳的同系物(N,N-二甲基氨基丙基)-氨基甲?；鵠膽固醇（DMAPA-Chol）；和CHEMS-NHS反應(yīng)生成鏈接基團(tuán)為琥珀酸基的N-(N’,N’-二甲基)乙基丁二酸單膽固醇酯單酰胺（DC-CHEMS）和多一個(gè)碳的N-(N’,N’-二甲基)丙基丁二酸單膽固醇酯單酰胺（DMAPA-CHEMS）。合成并純化的產(chǎn)物經(jīng)TLC、質(zhì)譜和1H-H

3、MR譜分析，確證為目標(biāo)產(chǎn)物。
　　用薄膜分散法以陽(yáng)離子膽固醇衍生物和大豆磷脂S100為膜材制備脂質(zhì)體，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)和細(xì)胞毒性以及細(xì)胞內(nèi)攝取、轉(zhuǎn)染等的評(píng)價(jià)。DC-Chol、DMAPA-Chol、DC-CHEMS、DMAPA-CHEMS脂質(zhì)體的數(shù)均粒徑分別為115.8±9.3nm、118.0±15.3nm、120.0±14.2nm、124.1±12.8nm，表面電位分別為16.94±1.56mv、17.40±0.76mv、23

4、.63±2.52mv、26.76±3.60mv。四種脂質(zhì)體形態(tài)規(guī)整，幾乎都呈圓形。當(dāng)+/-電荷比在4:1以上時(shí)，四種脂質(zhì)體均能將pDNA阻滯在上樣孔處，并都有較強(qiáng)的保護(hù)pDNA的能力。四種脂質(zhì)體的溶血率都在2％以下。MTT結(jié)果顯示，當(dāng)磷脂濃度在0.05mg/ml以下時(shí)，四種脂質(zhì)體的細(xì)胞存活率都在80%以上，細(xì)胞毒性低。+/-電荷比在一定范圍內(nèi)，脂質(zhì)體/F-ODN的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨著脂質(zhì)體用量的增加而增加，而且在最低+/-=1:1時(shí)的攝取

5、效果大于市售試劑Lipofectamine?2000。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，四種脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效果低下，明顯低于市售試劑Lipofectamine?2000。
　　普通的陽(yáng)離子膽固醇脂質(zhì)體中引入R8后，與pDNA的結(jié)合能力增加；細(xì)胞毒性相對(duì)增加，但增加的幅度不大，DC-CHEMS組的毒性幾乎不變，存活率達(dá)100%，變化較大的是DC-Chol組，磷脂濃度在0.01mg/ml以下時(shí)，細(xì)胞的存活率約為80%；脂質(zhì)體與R8孵育后能促進(jìn)復(fù)合物

6、入胞，DMAPA-Chol脂質(zhì)體組促進(jìn)效果最明顯，平均熒光強(qiáng)度提高2.14倍，DC-Chol、DC-CHEMS、DMAPA-CHEMS脂質(zhì)體組分別為1.50倍、1.21倍、1.43倍；但細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的結(jié)果，在原來(lái)的基礎(chǔ)上沒(méi)有任何改善，只有少量的pDNA表達(dá)，與Lipofectamine?2000的轉(zhuǎn)染效果相差很大。雖然加入R8后的復(fù)合物更能促進(jìn)入胞，但目的基因在胞內(nèi)的命運(yùn)并沒(méi)有改變，轉(zhuǎn)染效率依然低下。
　　以陽(yáng)離子

7、膽固醇衍生物和DOPE為膜材制備脂質(zhì)體，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)和細(xì)胞水平的評(píng)價(jià)。DC-Chol、DMAPA-Chol、DC-CHEMS、DMAPA-CHEMS脂質(zhì)體的數(shù)均粒徑分別為173.3±6.4nm、179.9±8.1nm、147.6±5.9nm、149.1±5.1nm，表面電位分別為24.46±4.50mv、25.33±5.19mv、27.38±4.22mv、29.21±3.69mv；四種脂質(zhì)體在+/-為8:1-1:8范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染效

8、果有個(gè)最強(qiáng)值，效果明顯優(yōu)于Lipofectamine?2000；在同一+/-時(shí)，發(fā)現(xiàn)加入R8的脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率反而沒(méi)有不加R8的好，原因可用胞內(nèi)分布的結(jié)果初步分析，DOPE脂質(zhì)體介導(dǎo)的F-ODN主要位于細(xì)胞核，加入R8后主要位于細(xì)胞核周?chē)?，而S100脂質(zhì)體介導(dǎo)的F-ODN在細(xì)胞核中含量最少。Western blot結(jié)果顯示，DC-CHEMS和DMAPA-CHEMS組的蛋白條帶比DC-Chol和DMAPA-Chol的淺，說(shuō)明DC-CHEM