氧化還原敏感型聚酰胺-胺及其膽固醇衍生物作為siRNA遞送載體的研究.pdf

1、小干擾RNA(siRNA)是一種含有21~23個堿基對的雙鏈RNA,利用siRNA作為RNA干擾(RNAi)的效應分子在治療疾病時具有特異性好、效率高、持續(xù)時間長等特點,因此 siRNA在疾病治療方面(如癌癥、遺傳性疾病或病毒感染性疾病等)展現(xiàn)出良好的潛力和發(fā)展前景。但siRNA分子量較大、水溶性好、荷負電、易被RNA酶降解、且易受細胞膜屏障的影響導致基因沉默效率較低,嚴重限制了 siRNA在疾病治療中的廣泛應用。因此,探索和研發(fā)安全有

2、效的非病毒載體系統(tǒng)用于遞送siRNA并實現(xiàn)基因治療是一個亟需解決的難題。
　　本研究設(shè)計并合成了一種聚酰胺-胺(rPAA)高分子材料,其結(jié)構(gòu)特征為:(1)聚合物鏈中含有多種不同類型的氨基,有利于增強載體的溶酶體逃逸能力;(2)聚合物鏈中含有較豐富的二硫(S-S)鍵,利用其在特定的氧化-還原環(huán)境中可產(chǎn)生聚合鏈裂解,從而具有良好的解組裝能力,利于有效釋放 siRNA。我們利用該rPAA聚合物材料單獨或與其它聚合物(如透明質(zhì)酸,HA)共

3、同構(gòu)建功能性siRNA遞送載體,以期通過提高遞送載體的細胞攝取能力、增強載體的溶酶體逃逸能力以及改善載體的胞內(nèi)解組裝能力等技術(shù)手段,顯著改善 siRNA遞送效率。在此rPAA聚合物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,我們又通過化學修飾的方式將膽固醇分子以兩種不同的接枝方式修飾到rPAA聚合鏈上獲得rPAA-Ch和rPAA-ChBr兩類聚合物,并對這些聚合物及其組裝的載體系統(tǒng)的制劑學性質(zhì)和生物學性能進行了較為系統(tǒng)的體內(nèi)外評價,以期進一步尋找和探索更加高效安全的s

4、iRNA遞送載體。本課題的研究內(nèi)容主要包括以下四個部分:
　　(1) rPAA合成工藝的優(yōu)化
　　考察了單體的濃度、兩種單體的摩爾比、反應時間和溫度等因素對rPAA的平均分子量(Mw)和分子結(jié)構(gòu)(線性或支化)的影響,結(jié)果顯示:在一定反應時間范圍內(nèi),隨著反應時間的延長,rPAA的平均Mw逐漸增加;兩種單體在較高的摩爾濃度且摩爾比為1:1時,更容易獲得較高Mw的聚合物。另外,反應溫度也會明顯影響產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu):在較高的反應溫度下(

5、如55℃),易得到高支化rPAA;在較低的反應溫度下(如37℃),易得到直鏈rPAA。由此可見,通過對合成反應工藝條件和參數(shù)的優(yōu)化,可獲得分子量可調(diào)節(jié)、支化程度可控的合成工藝,為后續(xù)siRNA遞送載體材料的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　(2)以高支化rPAA和HA為載體構(gòu)建siRNA三元復合物的研究
　　本研究合成了一種高支化結(jié)構(gòu)的rPAA(命名為PCD),與siRNA和HA組裝形成 siRNA/PCD/HA三元復合物遞送載體

6、,并比較了該三元復合物的三種不同混合順序的組裝方式在生物學性質(zhì)評價中的差異:(1)混合方式I(mixing order I),將siRNA溶液與PCD溶液進行混合得到二元復合物,然后再加入HA溶液進行混合得到三元復合物。(2)混合方式II(mixing order II),將HA溶液與PCD溶液進行混合得到二元復合物,然后加入siRNA溶液進行混合得到siRNA三元復合物。(3)混合方式III(mixing order III),將HA

7、溶液與siRNA溶液進行混合,然后加入 PCD溶液進行混合得到 siRNA三元復合物。以乳腺癌細胞系 MCF-7(低CD44表達)和MDA-MB-231(高CD44表達)細胞為模型,考察了不同混合順序(I、II、III)組裝形成的納米粒子在粒徑、電位、細胞攝取、血清穩(wěn)定性和siRNA遞送效率等方面的差異,研究結(jié)果顯示:合成PCD高分材料在上述兩個細胞的細胞毒性低于市售轉(zhuǎn)染試劑bPEI25 kDa,而其緩沖能力和細胞轉(zhuǎn)染效率均明顯高于bP

8、EI25 kDa,且PCD可表現(xiàn)出在氧化-還原環(huán)境條件下特異性釋放siRNA。
　　在三組分混合順序考察中發(fā)現(xiàn),在較優(yōu) siRNA/PCD/HA的電荷比(P/N/C)為1/20/16時,三種混合方式所制備粒子的粒徑和電位分別為124.8 nm和27.3 mV(混合方式I),147.5 nm和29.9 mV(混合方式II),128.8 nm和19.4 mV(混合方式III)。研究還發(fā)現(xiàn):混合方式I和III制備的三元復合物載體對siN

9、RA的保護效果(血清穩(wěn)定性)和在上述兩個細胞系內(nèi)的細胞攝取都要優(yōu)于混合方式 II制備的三元復合物載體。在較優(yōu)的電荷比(P/N/C)為1/20/16時,在 MDA-MB-231細胞內(nèi),血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的基因沉默效率呈如下趨勢:混合方式III>混合方式 I>混合方式 II。由此可見,siRNA/PCD/HA三組分均可按層層組裝(layer-by-layer)的方式依賴靜電作用形成納米粒子,不同混合順序組裝得到的納米粒子具有不同的

10、結(jié)構(gòu)特征,進而導致不同的細胞攝取和 siRNA遞送效率。這些研究結(jié)果對于三元復合物處方工藝的優(yōu)化具有重要的指導意義。
　　(3)膽固醇修飾的rPAA-Ch聚合物作為siRNA遞送載體的研究
　　本研究利用膽固醇氯甲酸酯與rPAA主鏈上的仲胺以形成酰胺鍵的方式合成兩親性rPAA-Ch聚合物。通過調(diào)整膽固醇氯甲酸酯和rPPA的投料比,我們獲得了不同接枝率的rPAA-Ch聚合物,包括rPAA-Ch14(接枝率為14％)、rPAA-

11、Ch29(接枝率為29%)、rPAA-Ch57(接枝率為57%)和 rPAA-Ch87(接枝率為87%)。這些兩親性rPAA-Ch聚合物均可在較低的濃度下在水溶液中自組裝形成納米粒子,通過冷凍透射電鏡(Cryo-TEM)和動態(tài)光散射技術(shù)(DLS)證實了自組裝納米粒子的形成。rPAA-Ch空白納米粒的粒徑在80-160 nm之間,電位為50-60 mV。四種不同膽固醇接枝率的rPAA-Ch聚合物的體外性質(zhì)評價結(jié)果顯示,隨著膽固醇接枝率的增

12、加,載體材料的毒性逐漸降低、載體的細胞攝取逐漸增加,緩沖能力逐漸減弱,CMC值逐漸減小。以人乳腺癌MCF-7細胞和人肝癌Hep G2細胞為模型,不同材料對 siRNA的體外遞送效率從高到低依次是:rPAA-Ch57>rPAA-Ch87>rPAA-Ch29>rPAA-Ch14≥rPAA。在以MCF-7乳腺癌細胞為模型的考察研究中發(fā)現(xiàn),rPAA-Ch57載體具有較高的細胞攝取,最好的VEGF基因沉默效率和最優(yōu)的MCF-7腫瘤生長抑制效果。膽

13、固醇抑制試驗和內(nèi)吞抑制劑試驗進一步證實rPAA-Ch57載體較優(yōu)的siRNA遞送效率與其結(jié)構(gòu)中膽固醇含量相關(guān),該納米載體粒子可通過網(wǎng)格蛋白介導的和陷穴小泡介導的內(nèi)吞方式進入細胞,然后經(jīng)過內(nèi)涵體-溶酶體途徑;共聚焦顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)rPAA-Ch57納米載體具有良好的溶酶體逃逸能力和載體解組裝能力,有利于遞送載體從溶酶體逃逸進入胞漿內(nèi)釋放siRNA,進而發(fā)揮基因沉默效應。這些結(jié)果表明,rPAA-Ch57聚合物是一個具有較好發(fā)展?jié)摿Φ膕iRNA

14、遞送載體材料。
　　(4)膽固醇修飾的rPAA-ChBr聚合物作為siRNA遞送載體的研究
　　本研究通過形成溴化季銨鹽的方式將膽固醇分子化學修飾到rPAA主鏈上并獲得四種不同接枝率的rPAA-ChBr聚合物,包括rPAA-ChBr15(接枝率為15%)、rPAA-ChBr30(接枝率為30%)、rPAA-ChBr60(接枝率為60%)和rPAA-ChBr90(接枝率為90%)。通過動態(tài)光散射技術(shù)(DLS)證實了空白自組裝納

15、米粒子的形成?？疾炝瞬煌懝檀冀又β蕦酆衔锏睦砘再|(zhì)、細胞毒性、細胞攝取、siRNA遞送效率等方面的影響,研究結(jié)果顯示:隨著膽固醇接枝率的增加,rPAA-ChBr空白納米粒的粒徑(從150 nm增加至350 nm)和電位(從60 mV到100 mV)逐漸增加;CMC和緩沖能力逐漸降低。以MCF-7乳腺癌細胞為模型,評價比較了四種rPAA-ChBr材料促進 siRNA細胞攝取能力:Lipofectamine> rPAA-ChBr60≈r

16、PAA-ChBr30>rPAA-ChBr15≈rPAA≈PEI25k>rPAA-ChBr90。以MCF-7乳腺癌細胞和Hep G2肝癌細胞為模型,考察四種rPAA-ChBr/siRNA載體系統(tǒng)在細胞水平上的基因沉默效率:rPAA-ChBr30> rPAA-ChBr15> rPAA-ChBr60>rPAA-ChBr90。上述結(jié)果表明,rPAA-ChBr30也可能是一個具有發(fā)展?jié)摿Φ膕iRNA遞送載體。
　　綜上所述,本研究合成了一種

17、具有良好發(fā)展?jié)摿Φ难趸€原敏感型聚酰胺-胺高分子材料(rPAA),并在此材料基礎(chǔ)上,考察評價了不同混合組裝方式的三元復合物在載運siRNA效率上的差異;同時研究了在rPAA母鏈結(jié)構(gòu)上不同膽固醇修飾方式和不同膽固醇接枝率對siRNA遞送效率的差異。研究結(jié)果證實,rPAA高分子材料具有良好的氧化還原敏感性,具有良好的siRNA包載和遞送能力,其膽固醇修飾的衍生物將有可能開發(fā)成為具有良好運載 siRNA效能的新型非病毒載體材料,為進一步設(shè)計開