轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA的PEG化EGFR靶向免疫脂質(zhì)體的制備及抗肝癌作用的研究.pdf

1、小干擾RNA(siRNA)能通過RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)在mRNA水平通過抑制靶基因的表達(dá)從而下調(diào)蛋白的表達(dá)。siRNA因其高特異性的基因沉默效率和低毒性等特點(diǎn)被認(rèn)為是最具潛力的抗腫瘤藥物。然而由于血液中存在的核酸酶及帶正電荷的一些蛋白的存在使siRNA在血液中不穩(wěn)定，這就使得將siRNA傳遞到腫瘤細(xì)胞成為一個(gè)非常具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。為了解決這個(gè)問題，許多siRNA傳遞系統(tǒng)發(fā)展起來。在這些系統(tǒng)中，主要包括

2、：脂質(zhì)依賴的系統(tǒng)、聚合物依賴的系統(tǒng)、肽結(jié)合系統(tǒng)、不同抗體單鏈片段融合蛋白系統(tǒng)。
　　 在這些不同載體系統(tǒng)中，陽離子脂質(zhì)體因具有可自然降解、生物相容性好；可以將siRNA濃縮為帶正電荷的磷脂復(fù)合物，免受核酸酶的降解等優(yōu)點(diǎn)，使其成為自20世紀(jì)八十年代受到研究者的重視和應(yīng)用最廣泛的載體。為了進(jìn)一步沉默靶基因，配體修飾的免疫脂質(zhì)體成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。目前，Huang等發(fā)明的茴香酰胺靶向的LPD載體系統(tǒng)能將siRNA有效地傳遞到σ受體過表

3、達(dá)的腫瘤細(xì)胞。為了使LPD成為使用更廣泛的載體系統(tǒng)，我們首次將抗體(anti-EGFR的Fab’)應(yīng)用在LPD上，制得高PEG含量的TLPD-FCC。研究結(jié)果顯示TLPD-FCC能有效的將siRNA傳遞到EGFR高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，并具有良好的體內(nèi)外基因沉默效率。然而，TLPD-FCC在EGFR高表達(dá)的肝癌細(xì)胞中并沒有顯示較好的基因沉默活性。因此，為了提高TLPD-FCC在肝癌細(xì)胞的基因沉默活性，本研究在我們之前的研究基礎(chǔ)上對(duì)TLPD-

4、FCC進(jìn)行了一些改造，包括降低PEG化程度和增加抗體連接效率等來優(yōu)化處方，然后對(duì)該處方進(jìn)行深入的體內(nèi)外抗腫瘤活性的研究。
　　 首先，我們通過薄膜分散法制備DOTAP/Chol脂質(zhì)體，然后將脂質(zhì)體與魚精蛋白、小牛胸腺DNA、siRNA混合制的裸的LPD，然后將PEG和抗體通過一定方式插入LPD中得到EGFR靶向的免疫脂質(zhì)體。由于PEG化程度和抗體連接方式是影響脂質(zhì)體靶向效率的兩個(gè)主要因素，因此我們制備了不同PEG化程度(含PEG

5、分別為5mol％、7.5mol％、10mol％)和不同抗體連接方式(傳統(tǒng)方法和后插入方法)的免疫脂質(zhì)體TLPD，然后以粒徑、zeta電位、抗體連接效率、siRNA基因沉默效率為指標(biāo)進(jìn)行處方優(yōu)化，最后得到通過后插入方法制備的含7.5mol％PEG的免疫脂質(zhì)體TLPD-FP75為最佳處方。
　　 然后我們考察了靶向與非靶向免疫脂質(zhì)體(TLPD-FP75和NTLPD-FP75)對(duì)siRNA的結(jié)合能力、包封率、siRNA的血清穩(wěn)定性、細(xì)

6、胞內(nèi)吞、轉(zhuǎn)染效率和基因沉默效率。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明NTLPD-FP75和TLPD-FP75對(duì)siRNA均具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，這與高包封率(>85％)的結(jié)果一致。體外血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明該載體能明顯的延長siRNA在血清中的時(shí)間至144h。通過共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)吞情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TLPD-FP75的細(xì)胞中CFPE和Cy5-siRNA標(biāo)記顯著高于含NTLPD-FP75細(xì)胞，說明TLPD-FP75可以通過配體-受體介導(dǎo)的方式將siRNA內(nèi)吞到細(xì)

7、胞內(nèi)。TLPD-FP75在不同EGFR表達(dá)的肝癌細(xì)胞(SMMC-7721/Hep3B/LM3)中轉(zhuǎn)染效率和基因沉默效率的結(jié)果表明：TLPD-FP75的轉(zhuǎn)染效率和基因沉默效率明顯高于NTLPD-FP75，且具有一定的抗原特異性。在抗RhoA-siRNA實(shí)驗(yàn)中，TLPD-FP75能有效的下調(diào)RhoA的表達(dá)并抑制細(xì)胞的遷移。
　　 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們建立了SMMC-7721裸鼠的肝臟原位癌模型，探討了轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA脂質(zhì)體的體內(nèi)分布情況

8、、細(xì)胞吸收及其基因沉默活性。體內(nèi)組織分布結(jié)果表明，同NTLPD-FP75組相比，TLPD-FP75組能顯著增加siRNA在腫瘤部位的聚集；另外體內(nèi)細(xì)胞吸收結(jié)果顯示，TLPD-FP75主要通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式有效的聚集在腫瘤細(xì)胞。更為重要的是TLPD-FP75的體內(nèi)基因沉默效率是要明顯高于其它形式的脂質(zhì)體。
　　 綜上，本研究通過后插入方法制備的含7.5mol％PEG的的免疫脂質(zhì)體能特異性的將siRNA傳遞到EGFR過表達(dá)的肝癌