轉運siRNA的PEG化EGFR靶向免疫脂質體的制備及抗肝癌作用的研究.pdf

1、小干擾RNA(siRNA)能通過RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術在mRNA水平通過抑制靶基因的表達從而下調蛋白的表達。siRNA因其高特異性的基因沉默效率和低毒性等特點被認為是最具潛力的抗腫瘤藥物。然而由于血液中存在的核酸酶及帶正電荷的一些蛋白的存在使siRNA在血液中不穩(wěn)定，這就使得將siRNA傳遞到腫瘤細胞成為一個非常具有挑戰(zhàn)性的任務。為了解決這個問題，許多siRNA傳遞系統(tǒng)發(fā)展起來。在這些系統(tǒng)中，主要包括

2、：脂質依賴的系統(tǒng)、聚合物依賴的系統(tǒng)、肽結合系統(tǒng)、不同抗體單鏈片段融合蛋白系統(tǒng)。
　　 在這些不同載體系統(tǒng)中，陽離子脂質體因具有可自然降解、生物相容性好；可以將siRNA濃縮為帶正電荷的磷脂復合物，免受核酸酶的降解等優(yōu)點，使其成為自20世紀八十年代受到研究者的重視和應用最廣泛的載體。為了進一步沉默靶基因，配體修飾的免疫脂質體成為當前的研究熱點。目前，Huang等發(fā)明的茴香酰胺靶向的LPD載體系統(tǒng)能將siRNA有效地傳遞到σ受體過表

3、達的腫瘤細胞。為了使LPD成為使用更廣泛的載體系統(tǒng)，我們首次將抗體(anti-EGFR的Fab’)應用在LPD上，制得高PEG含量的TLPD-FCC。研究結果顯示TLPD-FCC能有效的將siRNA傳遞到EGFR高表達的乳腺癌細胞，并具有良好的體內外基因沉默效率。然而，TLPD-FCC在EGFR高表達的肝癌細胞中并沒有顯示較好的基因沉默活性。因此，為了提高TLPD-FCC在肝癌細胞的基因沉默活性，本研究在我們之前的研究基礎上對TLPD-

4、FCC進行了一些改造，包括降低PEG化程度和增加抗體連接效率等來優(yōu)化處方，然后對該處方進行深入的體內外抗腫瘤活性的研究。
　　 首先，我們通過薄膜分散法制備DOTAP/Chol脂質體，然后將脂質體與魚精蛋白、小牛胸腺DNA、siRNA混合制的裸的LPD，然后將PEG和抗體通過一定方式插入LPD中得到EGFR靶向的免疫脂質體。由于PEG化程度和抗體連接方式是影響脂質體靶向效率的兩個主要因素，因此我們制備了不同PEG化程度(含PEG

5、分別為5mol％、7.5mol％、10mol％)和不同抗體連接方式(傳統(tǒng)方法和后插入方法)的免疫脂質體TLPD，然后以粒徑、zeta電位、抗體連接效率、siRNA基因沉默效率為指標進行處方優(yōu)化，最后得到通過后插入方法制備的含7.5mol％PEG的免疫脂質體TLPD-FP75為最佳處方。
　　 然后我們考察了靶向與非靶向免疫脂質體(TLPD-FP75和NTLPD-FP75)對siRNA的結合能力、包封率、siRNA的血清穩(wěn)定性、細

6、胞內吞、轉染效率和基因沉默效率。凝膠阻滯實驗表明NTLPD-FP75和TLPD-FP75對siRNA均具有較強的結合能力，這與高包封率(>85％)的結果一致。體外血清穩(wěn)定性實驗表明該載體能明顯的延長siRNA在血清中的時間至144h。通過共聚焦顯微鏡觀察細胞內吞情況，發(fā)現(xiàn)轉染TLPD-FP75的細胞中CFPE和Cy5-siRNA標記顯著高于含NTLPD-FP75細胞，說明TLPD-FP75可以通過配體-受體介導的方式將siRNA內吞到細

7、胞內。TLPD-FP75在不同EGFR表達的肝癌細胞(SMMC-7721/Hep3B/LM3)中轉染效率和基因沉默效率的結果表明：TLPD-FP75的轉染效率和基因沉默效率明顯高于NTLPD-FP75，且具有一定的抗原特異性。在抗RhoA-siRNA實驗中，TLPD-FP75能有效的下調RhoA的表達并抑制細胞的遷移。
　　 在體內實驗中，我們建立了SMMC-7721裸鼠的肝臟原位癌模型，探討了轉運siRNA脂質體的體內分布情況

8、、細胞吸收及其基因沉默活性。體內組織分布結果表明，同NTLPD-FP75組相比，TLPD-FP75組能顯著增加siRNA在腫瘤部位的聚集；另外體內細胞吸收結果顯示，TLPD-FP75主要通過受體介導的內吞方式有效的聚集在腫瘤細胞。更為重要的是TLPD-FP75的體內基因沉默效率是要明顯高于其它形式的脂質體。
　　 綜上，本研究通過后插入方法制備的含7.5mol％PEG的的免疫脂質體能特異性的將siRNA傳遞到EGFR過表達的肝癌