VitA偶聯(lián)脂質(zhì)體包裹MMP-2 siRNA靶向預(yù)防肝纖維化的體外研究.pdf

1、研究目的：制備VitA偶聯(lián)陽離子脂質(zhì)體，并以其為基質(zhì)金屬蛋白酶-2小干擾RNA(MMP-2siRNA)的載體，對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)進(jìn)行靶向干擾，檢測MMP-2靶向干擾對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化及Ⅰ型膠原分泌情況的影響，體外評(píng)估MMP-2靶向干擾對(duì)肝纖維化逆轉(zhuǎn)的影響。
　　研究方法：
　?、購腉eneBank中檢索大鼠MMP-2基因全長mRNA序列，設(shè)計(jì)3條MMP-2 siRNA靶序列(命名為A、B、C)和1條陰性對(duì)照序列

2、。轉(zhuǎn)染36h后，RT-PCR檢測MMP-2基因表達(dá)量，確定特異性siRNA的有效性。②以DCC-DMAP法合成VitA-腦磷脂活性脂，經(jīng)傅里葉紅外光譜分析對(duì)其表征。③以薄膜分散-超聲振蕩法制備陽離子脂質(zhì)體，并進(jìn)行VitA修飾。采用透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)、激光粒度分析儀對(duì)VitA修飾前后陽離子脂質(zhì)體外形、粒徑、分散度、zeta電位進(jìn)行分析。瓊脂糖凝膠電泳檢測陽離子脂質(zhì)體與siR

3、NA的結(jié)合情況。陽離子脂質(zhì)體包裹FAM-siRNA體外轉(zhuǎn)染HSC-T6，6h后熒光顯微鏡下觀察，檢測其轉(zhuǎn)染能力。MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其體外細(xì)胞毒性。④VitA偶聯(lián)脂質(zhì)體包裹MMP-2 siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6，做無血清培養(yǎng)，12h、24h、36h、48h、72h后分別收集細(xì)胞上清并提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR和明膠酶譜檢測靶向干擾后HSC-T6細(xì)胞MMP-2 mRNA及酶活性變化情況。⑤VitA聯(lián)脂質(zhì)體包裹MMP-2siRNA轉(zhuǎn)染HSCs

4、48h后，冷丙酮固定，觀察其形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞凋亡情況。免疫組織化學(xué)染色觀察MMP-2靶向干擾對(duì)HSC-T6α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響。
　　研究結(jié)果：①轉(zhuǎn)染36h后，收集細(xì)胞提取RNA，RT-PCR結(jié)果顯示3條siRNA的干擾效率相當(dāng)，分別為61.84％、52.87％、58.76％，在后續(xù)試驗(yàn)中，均以siRNA-A介導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞MMP-2基因沉默。②傅里葉紅外光譜分析可見VitA苯環(huán)及VitA和腦磷脂(phosphati

5、dylethanolamine，PE)脫水縮合后酰胺鍵的特征峰，驗(yàn)證了VitA與PE形成VitA-PE活性脂。③VitA修飾前后陽離子脂質(zhì)體近似球形，大多呈單室，分散性良好。修飾前粒徑為148.2±0.3 nm，zeta電位為41.67±0.52mV，修飾后平均粒徑為227.3±4.1nm，zeta電位為44.67±0.93mV。④MTT結(jié)果顯示，VitA修飾前后陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)HSC-T6細(xì)胞毒性低。陽離子脂質(zhì)體具有良好的

6、siRNA結(jié)合能力，可將外源siRNA傳遞到細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染FAM-siRNA6h后細(xì)胞內(nèi)即可出現(xiàn)綠色熒光，且VitA修飾后轉(zhuǎn)染效率高于修飾前。⑤siRNA轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后，明膠酶譜及RT-PCR結(jié)果顯示干擾48h后MMP-2基因表達(dá)水平及酶活性降到最低。轉(zhuǎn)染48h后，細(xì)胞體積變小，有絲分裂速率變慢。Hoechst凋亡染色顯示，MMP-2 siRNA靶向干擾并不促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞凋亡。⑥免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示MMP-2 siRNA靶向干擾后，

7、HSC-T6表達(dá)α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白水平顯著降低。
　　結(jié)論：①應(yīng)用薄膜分散-超聲振蕩法成功制備了陽離子脂質(zhì)體及VitA偶聯(lián)脂質(zhì)體。②VitA偶聯(lián)脂質(zhì)體對(duì)HSC-T6細(xì)胞毒性低，體外轉(zhuǎn)染HSCs效率高，為后續(xù)的RNA靶向干擾提供了一個(gè)有效的載體。③合成的MMP-2 siRNA可有效介導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞MMP-2基因沉默，為后面進(jìn)一步進(jìn)行體外肝纖維化治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。④體外干擾MMP-2表達(dá)，可降低HSCs增殖速率及活化，并減