肝靶向β-雌二醇納米粒制備及抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的: 本研究的目的為1、以氰基丙烯酸正丁酯(BCA)為載體材料，通過界面聚合法將β-雌二醇(E<,2>)包裹到納米載體中，制備肝靶向聚氰基丙烯酸正丁酯β-雌二醇納米粒(E2-PBCA-NP)。2、比較雌二醇納米化前后對豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型纖維化程度的治療效果。3、進(jìn)一步探討肝靶向納米粒E2-PBCA-NP和β-雌二醇治療肝纖維化的可能性。通過抑制大鼠肝纖維化動物模型的肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，提高抗氧化能力，下調(diào)T

2、GF-β、CTGF和TIMP-1的表達(dá)，上調(diào)MMP-1的表達(dá)，進(jìn)一步研究E2和E2-PBCA-NP抗肝纖維化作用的可能機(jī)制。 研究方法: 1、選擇BCA為載體材料，用界面聚合法研制了E<,2>-PBCA-NP。以E<,2>-PBCA-NP的包封率、形態(tài)、粒徑及其分布作為評價指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)作初選，均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)作精選的方法，優(yōu)選出制備E<,2>-PBCA-NP的最佳制備工藝。 2、用制備E<,2>-PBCA-N

3、P類似的方法制備<'125>I-E<,2>納米粒(<'125>I-E<,2>-PBCA-NP)；經(jīng)尾靜脈注射<'125>I-E<,2>和<'125>I-E<,2>-PBCA-NP及腹腔注射<'125>I-E<,2>-PBCA-NP后，在不同的時間點(diǎn)比較三組小鼠各組織中的<'125>I放射性強(qiáng)度，計(jì)算靶向指數(shù)，評價<'125>I-E<,2>-PBCA-NP在各個器官中的分布。 3、體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞株L-02作為體外細(xì)胞模型，采用對

4、照分組，檢測各組不同藥物濃度培養(yǎng)上清液LDH活性，以及用MTT法檢測細(xì)胞生長指數(shù)觀察E2-PBCA-NP、E<,2>和空白納米粒對肝細(xì)胞生長的影響和對肝細(xì)胞的毒性。 4、用不同劑量β-雌二醇和β-雌二醇納米粒作為干預(yù)藥物，對SD大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)進(jìn)行干預(yù)治療。用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞生長指數(shù)；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HSC-T6 α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)；免疫組化法檢測肝纖維化動物模型各組肝臟組織α-SM

5、A蛋白的表達(dá)。 5、β-雌二醇和β-雌二醇納米?？垢卫w維化作用機(jī)制研究：將SD大鼠隨機(jī)分成7組，每組10只，除正常對照組外，其余6組均腹腔注射豬血清(0.5 ml／次，2次／周)。β-雌二醇納米粒早期治療組在第5周給予腹腔注射藥物每周兩次；β-雌二醇納米粒晚期治療組、β-雌二醇治療組、γ-干擾素治療組、空白納米粒組、對照組和模型組在第9周給予腹腔注射相應(yīng)的干預(yù)藥物，每周兩次；在12周末處死大鼠。(1)HE和Masson染色觀察肝

6、臟病理改變。(2)留取血清和肝組織勻漿，用比法色檢測各組總抗氧化能力(T-AOC)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、谷胱甘肽(GSH)四項(xiàng)指標(biāo)。(3)RT-PCR檢測肝組織中I、Ⅲ膠原、TGF-β<'14>、CTGF、MMP-1和HMP-1mRNA的表達(dá)，同時免疫組化觀察TGF-β及CTGF蛋白的表達(dá)。(4)TGF-β<,1>和CTGF、MMP-1和TIMP-1之間作相關(guān)性分析。 6、將24只雌性大鼠隨機(jī)分成四組，包括

7、對照組、模型組、β-雌二醇納米粒和β-雌二醇治療組。除對照組外，其余3組均腹腔注射豬血清，兩組治療組在第9周腹腔注射β-雌二醇納米粒和β-雌二醇干預(yù)，在12周末處死大鼠。觀察各組性器官的重量和子宮內(nèi)膜增生的狀況。 結(jié)論: 1、通過優(yōu)選工藝制得的β-雌二醇納米粒大小、形狀、包封率可以滿足本實(shí)驗(yàn)研究的需要，該優(yōu)化工藝條件可作為β-雌二醇納米粒的最佳制備工藝。 2、β-雌二醇納米粒具有良好的肝靶向性。 3、空白

8、納米粒和β-雌二醇納米粒在10<'-6>mol／1的濃度范圍內(nèi)對肝細(xì)胞L-02無細(xì)胞毒性作用。 4、納米化后的β-雌二醇仍具有抗肝纖維的作用，與無納米化β-雌二醇比較抗肝纖維的作用更強(qiáng)。 5、β-雌二醇抗肝纖維化作用可能是通過抗氧化、抑制肝星狀細(xì)胞增殖和肝星狀細(xì)胞的α-SMA表達(dá)，降低Ⅰ、Ⅲ型膠原產(chǎn)生，抑制與肝纖維化有關(guān)的細(xì)胞因子。TGF-β及其下游信號CTGF的表達(dá)，以及促進(jìn)膠原降解MMP-1的表達(dá)和抑制TIMP-1的