基于MFH和靶向survivin基因的siRNA-As2O3磁性納米脂質(zhì)體的制備及介入治療肝癌的研究.pdf

1、目的:①研究用于腫瘤磁流體熱療的納米級(jí)Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁性納米粒子的制備及特征檢測(cè)。②研究As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4納米材料的制備工藝及聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)在其表面的修飾，制備出一將來(lái)可用于熱療、化療、基因治療多重抗腫瘤作用的復(fù)合納米材料。③構(gòu)建survivin-shRNA載體，并將載體進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定。通過(guò)轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)survivinmRNA水

2、平來(lái)測(cè)定其基因沉默的效率。④制備siRNA/As2O3磁性納米脂質(zhì)體，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物治療實(shí)驗(yàn)來(lái)研究Mn0.5Zn0.5Fe2O4熱療，As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4熱化療及siRNA/As2O3磁性納米脂質(zhì)體聯(lián)合治療肝癌的作用。
　　方法:①采用改良的化學(xué)共沉淀法制備Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁性納米粒子。利用透射電鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)，掃描電鏡(s

3、canningelectronmicroscope，SEM)，X射線衍射分析（x-raydiffraction，XRD），能譜儀(energydispersivespectrometer,EDS)對(duì)其形貌、物象、成份、磁性能及居里溫度等進(jìn)行分析表征，并在高頻交變磁場(chǎng)（altematingmagneticfield,AMF）下檢測(cè)其升溫情況。MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其體外細(xì)胞毒性。②采用超微粒子催化劑的制備方法—浸漬法來(lái)制備As2O3/Mn0.5Z

4、n0.5Fe2O4磁性納米材料，再在其表面進(jìn)行PEI修飾。采用TEM、SEM、EDS、傅立葉紅外光譜分析(Fouriertransforminfraredspectroscopy,FTIR)研究其表面特征。AMF下進(jìn)行體外磁感應(yīng)升溫，觀察PEI和As2O3在Mn0.5Zn0.5Fe2O4表面的吸附和修飾對(duì)其磁感應(yīng)升溫能力有無(wú)影響。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)磁性粒子As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4與DNA結(jié)合情況，體外轉(zhuǎn)染pEGFP質(zhì)粒

5、至肝癌細(xì)胞對(duì)其轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行表征。③從GeneBank中檢索人survivin基因全長(zhǎng)mRNA序列（GeneBank序列號(hào):NM-001168），并參考文獻(xiàn)發(fā)表的有效序列，篩選出4條survivinsiRNA靶序列，并構(gòu)建survivin-shRNA表達(dá)載體（短發(fā)夾RNA表達(dá)載體，可在細(xì)胞內(nèi)由Dicer酶切割后得到siRNA），分別命名為1-4號(hào)，使用的載體為:pGPU6/GFP/Neo。使用PromegaPureYieldTMPlasm

6、idMaxiprepSystemKit擴(kuò)增survivin-shRNA表達(dá)載體。使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染survivin-shRNA表達(dá)載體至HepG-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)和48小時(shí)后，用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，拍照。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，用RT-PCR方法檢測(cè)HepG-2細(xì)胞survivin-mRNA表達(dá)情況，篩選出基因沉默效率最高的一條surviVin—shRNA，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。④制備siRNA/

7、As2O3磁性納米脂質(zhì)體。體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，各組細(xì)胞處理后通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值率，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。分組如下:空白對(duì)照組（RPMI1640培養(yǎng)液）、Mn0.5Zn0.5Fe2O4非熱療組、Mn0.5Zn0.5Fe2O熱療組、As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O熱療組、siRNA/As2O3磁性納米脂質(zhì)體熱療組。從VX2荷瘤兔身上取下腫塊，剔除結(jié)締組織和壞死組織后，用眼科剪剪成盡可能小的瘤粒（＜1mm3），接種

8、于兔兩后腿皮下作為傳代。采用開(kāi)腹瘤粒懸液注射法建立兔VX2肝癌模型，抽血查肝腎功能，術(shù)后14天行CT檢查和DSA(digitalsubtractionangiography)造影。模型建立14天后，進(jìn)行介入治療和熱療，分組如下空白對(duì)照組、Mn0.5Zn0.5Fe2O4非熱療組、Mn0.5Zn0.5Fe2O4熱療組、As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O熱療組、siRNA/As2O3磁性納米脂質(zhì)體熱療組、阿霉素治療組，每組6只。介入手術(shù)

9、48小時(shí)后，將三組熱療組動(dòng)物置交變磁場(chǎng)下進(jìn)行熱療60分鐘，共熱療三次，每次間隔48小時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都于介入術(shù)后14天處死，進(jìn)行尸檢，剝離腫瘤，用尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)短徑，計(jì)算腫瘤體積。根據(jù)公式:腫瘤體積抑制率(％)=（1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積/對(duì)照組腫瘤體積）×100％，計(jì)算腫瘤體積抑制率。常規(guī)制片，HE染色、光鏡下形態(tài)學(xué)觀察。免疫組織化學(xué)法（SP法）檢測(cè)survivin的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:①自制的Mn0.5Zn0.5Fe2O4納米粒近

10、似圓形和球形，大小較一致，分散性良好，粒徑約20-30mm。EDS分析其包含Mn，Zn，F(xiàn)e三種元素，且Mn，Zn，F(xiàn)e元素的摩爾比接近1∶1∶4;XRD顯示制備的Mn0.5Zn0.5Fe2O4各衍射峰所對(duì)應(yīng)的面間距（d值）與粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會(huì)(JCPDS)編制的代表物質(zhì)為尖晶石型磁性的PDF(PowderDiffractionFile)卡片d值吻合一致，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)證明為錳鋅鐵氧體。居里溫度為210.1℃。在交變磁場(chǎng)下，濃度為159/L

11、的Mn0.5Zn0.5Fe2O4可升溫至45℃并保持恒定。37℃所制備的Mn0.5Zn0.5Fe2O4浸漬液對(duì)L-929細(xì)胞毒性為0～1級(jí)，無(wú)細(xì)胞毒性。②PEI-As2O3/Mn0.5Fe2O4電鏡下外觀仍為圓形或球形，分散性良好，大小較均勻一致，平均粒徑為30-40nm。FTIR可見(jiàn)到PEI的-NH2和-CH2-特征峰的存在，EDS分析圖譜可見(jiàn)N、As、Mn、Zn、Fe元素，驗(yàn)證了PEI和AS2O3在磁性納米粒子表面的吸附。與Mn0.

12、5Zn0.5Fe2O4磁性納米粒相比，它們升溫能力相同。PEI/Mn0.5Zn0.5Fe2O4具有良好的DNA結(jié)合保護(hù)轉(zhuǎn)染能力，可將外源pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人肝癌HepG2細(xì)胞，24小時(shí)后即可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)。③survivin-shRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后即可見(jiàn)到綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，視野內(nèi)熒光均勻分布，48小時(shí)后有更多細(xì)胞表達(dá)GFP，提示survivin-shRNA表達(dá)質(zhì)粒已有效進(jìn)入了HepG2細(xì)胞。

13、轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)survivin基因的沉默效率。1號(hào)survivin-shRNA的基因沉默效率為最佳，以GAPDH為內(nèi)參照，1號(hào)survivin灰度比值較陰性對(duì)照組下降90％。結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染1號(hào)survivin-shRNA可介導(dǎo)HepG2細(xì)胞survivin基因沉默，實(shí)現(xiàn)survivin基因的靶向封閉，其相對(duì)應(yīng)的survivinsiRNA序列為5’-GGACCACCGCATCTCTACA-3’。④

14、MTT法顯示，Mn0.5Zn0.5Fe2O4未熱療組細(xì)胞增殖率為95.38％，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。其余各組增殖率分別為78.51％、51.00％和38.96％，與對(duì)照組相比具備明顯差異(P＜0.05)。各組HepG2細(xì)胞經(jīng)處理48h后，空白對(duì)照組未見(jiàn)明顯凋亡峰，凋亡率僅為1.6％，Mn0.5Zn0.5Fe2O4未熱療組為4.89％。Mn0.5Zn0.5Fe2O4熱療組凋亡率為21.07％，As2O3/Mn0.5Zn0

15、.5Fe2O4熱療組為39.46％，siRNA/As2O3磁性納米脂質(zhì)體熱療組為41.93％。模型建立方法可成功建立兔VX2肝癌模型，并對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝腎功能沒(méi)有明顯的影響，14天后腫瘤可于CT下顯像，腫瘤長(zhǎng)徑平均可長(zhǎng)至1.5-2cm，切面出血壞死少，無(wú)肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移。種植14天后，DSA造影結(jié)果示腫瘤血管不規(guī)則，紊亂，腫瘤實(shí)質(zhì)染色明顯，內(nèi)部染色不均勻。介入治療完成后14天，動(dòng)物尸檢發(fā)現(xiàn)對(duì)照組腫瘤平均體積為34.29±9.24mm3，Mn0.

16、5Zn0.5Fe2O4熱療組，As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O熱療組、siRNA/As2O3磁性納米脂質(zhì)體組與阿霉素組的體積抑制率分別為70.84％、85.19％、92.51％、49.14％，與對(duì)照組相比其腫瘤體積差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而單純Mn0.5Zn0.5Fe2O4非加熱組體積抑制率為1.87％，與對(duì)照組相比其腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。鏡下觀察可見(jiàn)各組腫瘤內(nèi)部均可見(jiàn)到腫瘤組織壞死，結(jié)構(gòu)紊亂，腫

17、瘤核分裂像多見(jiàn)，周?chē)８谓M織結(jié)構(gòu)清晰。C、D、E三組在鏡下可見(jiàn)棕褐色的納米磁粒子沉積在腫瘤及周?chē)g質(zhì)內(nèi)，周?chē)[瘤組織有明顯壞死，結(jié)構(gòu)不清。免疫組織化學(xué)法示對(duì)照組腫瘤可見(jiàn)survlvm呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(+++)，siRNA/As2O3磁性納米脂質(zhì)體組腫瘤的表達(dá)呈明顯下降，呈弱陽(yáng)性表達(dá)(+)。
　　結(jié)論:①采用改良的化學(xué)共沉淀法和浸漬法能成功制備出同時(shí)具備熱療、化療和基因治療三重功效的新型復(fù)合納米材料PEI-As2O3/Mn0.5Zn0

18、.5Fe2O4。②合成的survivin-shRNA可有效介導(dǎo)HepG2細(xì)胞survivin基因沉默，實(shí)現(xiàn)survivin基因的靶向封閉，為后面進(jìn)一步進(jìn)行肝癌的綜合治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。③采用開(kāi)腹瘤粒懸液注射法可以成功建立兔肝癌模型，腫瘤種植14天后，腫塊大小在1.5-2cm，適合進(jìn)行介入治療。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物治療實(shí)驗(yàn)均示Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁性材料本身對(duì)腫瘤并無(wú)毒性作用，而將其置入交變磁場(chǎng)后進(jìn)行熱療則具有良好的抑制腫瘤生