基于MFH與熱控基因表達技術(shù)的磁性pHsp-HSV-TK-As-,2-O-,3-復合納米粒的制備及對肝癌細胞的治療研究.pdf

1、目的： ①研究Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁性納米粒及As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復合納米粒的制備及表征；②PEI對磁性As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復合納米粒的表面修飾，特性檢測及作為基因載體可行性的研究；③PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復合納米粒的生物相容性評價；④以PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復合納米粒作為HSV-TK基因的載體對培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2

2、治療作用的研究。 方法： ①采用改良的化學共沉淀法制備Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁性納米粒子，過量浸漬法制備As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4，聚乙烯亞胺（PEI）對其進行表面修飾。②采用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM），掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM），X射線衍射分析（x-ray diffraction，XRD）

3、，傅立葉紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR），能譜儀（energy dispersive spectrometer， EDS）對修飾前后的磁性復合納米粒進行分析表征，原子熒光光度儀分析修飾前后復合物中的As含量及體外釋藥率，并在高頻交變磁場（AMF）下檢測Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁流體的升溫情況。③采用Bradford法測定PEI在納米粒子上的吸附量，瓊脂糖凝膠電泳檢

4、測PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4結(jié)合DNA的情況。利用pEGFP-C1觀察PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4介導外源基因轉(zhuǎn)染的效率及應用β-gal報告基因系統(tǒng)檢測hsp70啟動子經(jīng)不同溫度熱誘導后基因在不同時間的表達情況。④采用MTT實驗、溶血試驗、微核試驗、小鼠LD50檢測等方法評價修飾后磁性納米粒子的生物相容性。⑤以修飾的復合材料作為pHsp70-HSV-TK質(zhì)粒的載體，轉(zhuǎn)染入肝癌細胞HepG2中

5、，并置于交變磁場中感應升溫，誘導HSV-TK基因的表達。⑥MTT（methyl thiazolyl tetrazolium）法，流式細胞儀評價熱敏基因pHsp70-HSV-TK聯(lián)合熱化療對肝癌細胞生長的影響。 結(jié)果： ①制備的Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁性納米粒表征：TEM檢測顯示磁性納米粒為圓形、電子密度高、大小較一致；EDS證實制備的Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁性納米粒含有Mn，Zn，F(xiàn)e與O四種元素，且Mn

6、，Zn，F(xiàn)e元素的摩爾比符合0．5：0．5：2； XRD顯示制備的Mn0．5Zn0．5Fe2O4納米粒子各衍射峰所對應的面間距（d值）與粉末衍射標準聯(lián)合會（JCPDS）編制的代表物質(zhì)為尖晶石型磁性的PDF（Powder Diffraction File）卡片d值吻合一致，由峰值寬度計算其粒徑在6nm-22nm之間。②制備的As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復合納米粒表征：SEM檢測顯示為圓形，密度、大小較均勻，直徑平均約20nm

7、； EDS證實制備的納米材料含有As、Mn、Zn、Fe及O四種元素。③體外升溫試驗：在輸出電流30A，輸出頻率230kHz的AMF作用下不同濃度的Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁性納米粒混懸液能升溫到39℃～50℃，且加熱40min后溫度能恒定在某一水平不發(fā)生改變。④修飾后的PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4表征：TEM顯示修飾后的納米粒子具有良好的分散性，F(xiàn)TIR及EDS分析驗證了PEI在磁性納米粒子表面的吸附，修飾前

8、后復合物中As的含量分別為4．46％和3．1％且可緩慢持續(xù)釋放，升溫試驗證實修飾后的As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4仍具有良好的升溫恒溫能力。⑤Bradford法測定PEI在納米粒子上的最大吸附量可達9．81mg/g；瓊脂糖凝膠電泳檢測到PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4與DNA結(jié)合情況良好：PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4可將外源基因轉(zhuǎn)染至HepG2細胞系并高效表達，且隨溫度的升高基因表達量

9、增加，在43．5℃達高峰，隨時間的變化基因表達量呈現(xiàn)先升高后降低的情況并在24h時達高峰。⑥L-929細胞MTT實驗、溶血試驗、微核實驗證實PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復合納米粒無溶血作用、毒性低及無致畸致突變作用、符合生物材料的安全性要求；小鼠LD50檢測發(fā)現(xiàn)PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復合納米粒的LD50為3．449g/kg，95％的可信區(qū)間為2．87-4．51g/kg，具有較廣的安全值范

10、圍。⑦RT-PCR方法檢測到了HSV-TK基因在HepG2細胞中的表達。⑨MTT實驗顯示PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4-HSV-TK（即磁性pHsp-HSV-TK/As2O3復合納米粒）能顯著抑制人肝癌HepG2細胞的增殖，F(xiàn)CM檢測顯示其能誘導HepG2細胞的凋亡及周期阻滯，且其效果較單純As2O3液及單純磁流體熱療組明顯。 結(jié)論： ①應用化學共沉淀法及浸漬法已成功制備了Mn0．5Zn0．5Fe2O

11、4磁性納米粒和As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復合納米粒且PEI成功地包覆于As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4的表面。②修飾前后的復合納米粒具有良好的磁響應性及吸收磁能而升溫的能力，且可以作為基因的載體。③制備的PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復合納米粒具有良好的生物相容性、可以進一步用于腫瘤的聯(lián)合治療。④細胞實驗顯示：PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4-HSV-TK復合納米粒的三重治