聯合轉運siRNA與EPI的pH敏感長循環(huán)逆轉多藥耐藥納米載體的研究.pdf

1、在腫瘤治療中，內源性或獲得性的多藥耐藥是化療過程中的主要障礙，其降低藥物在細胞內的積累或增強腫瘤細胞DNA損傷修復機制，導致單種藥物治療腫瘤的效率降低?；蛩幬锟梢砸种萍毎嗨幠退幍陌l(fā)生，但是遞送過程面臨較多困難，因此選擇合適的載體，將基因與化療藥物聯合共遞送至腫瘤組織，以發(fā)揮藥效，是治療腫瘤的一個新策略。本課題制備了一種聯合轉運siRNA與表阿霉素（EPI）的pH敏感長循環(huán)逆轉多藥耐藥多功能信封式納米載體（Multifunction

2、Envelop-type Nano Device，MEND）。MEND是以壓縮的DNA、siRNA等為核心，用含有功能性配體的脂質體包裹而成的類似信封式外殼的納米微球，兼具了納米粒和脂質體的優(yōu)點。選用聚乙二醇（PEG）連接至磷脂分子二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE）上形成的共聚物DSPE-PEG，實現長循環(huán)的目的。通過邁克爾加成反應，合成具有酸敏感性能的含縮酮鍵的聚β氨基酯結構（KPAE），其通過正負電結合作用，縮合siRNA；在細胞酸

3、性環(huán)境中，KPAE的縮酮建斷裂，實現siRNA的智能釋放。BCL-2-siRNA通過調低P糖蛋白（P-gp）的表達和促進細胞凋亡，逆轉細胞多藥耐藥的發(fā)生，協(xié)同表阿霉素起到治療腫瘤的作用。各成分通過核磁共振、凝膠滲透色譜進行結構鑒定；本實驗選用薄膜分散法制備復合物載體，EPI包裹在脂質體薄膜的磷脂雙分子層疏水端，KPAE/siRNA縮合物溶液水化脂質體薄膜后，得到EPI/siRNA-MEND。利用透射電鏡觀察其形態(tài)；馬爾文激光粒度儀測定其

4、粒徑及電位；瓊脂糖凝膠電泳實驗考察復合物對的siRNA縮合能力；分別采用濾膜法-高效液相色譜法和超濾離心法，測定EPI和siRNA的包封率；實驗細胞選用人肝癌HepG2細胞，選用BCL-2-siRNA（siBCL-2）制備EPI/siBCL-2-MEND，采用MTT法，考察EPI/siBCL-2-MEND對肝癌HepG2細胞存活率的影響；采用熒光標記法，分別用FAM標記siRNA，LysoTracker-Blue DND-22標記溶酶體

5、，Hoechst33342標記細胞核，考察EPI/FAM-siRNA-MEND在肝癌HepG2細胞的分布以及溶酶體逃逸現象；采用流式細胞法，考察EPI/FAM-siRNA-MEND對肝癌HepG2細胞的轉染效率；用EPI/siBCL-2-MEND，對HepG2細胞轉染，考察P-糖蛋白（P-gp）的表達。采用小動物活體成像技術，考察EPI/Cy5-siRNA-MEND的體內分布。結果表明，成功合成了所需的各目標產物；MEND呈規(guī)則的球形且

6、具有明顯的脂質雙分子層結構和指紋結構；EPI/siRNA-MEND平均粒徑為121.6 nm，平均電位為+41.5 mV；載體復合物對EPI和siRNA的包封率分別為86.13%和97.07%；MEND在一定給藥劑量范圍內毒性較小，對細胞存活率幾乎無影響；EPI/siBCL-2-MEND高于同濃度下單獨藥物的腫瘤細胞抑制率，并具有較高的轉染效率；相比于游離的EPI組和EPI-MEND組，EPI/siBCL-2-MEND 可顯著