磁性靶向治療動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)性疾病是嚴重危害人類健康的一大類疾病,致死、致殘率高。目前對動脈粥樣硬化仍無好的治療方法,主要是通過識別動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊(unstable plaque)并及早臨床干預(yù),增強斑塊的穩(wěn)定性。而基因治療(Gene therapy)是穩(wěn)定動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊很有前途的一種治療方法。近年來的研究表明,載脂蛋白(Apo-AI)和B族I型清道夫受體(SR-BI)的表達對動脈粥樣硬化均具有保

2、護作用,其過度表達均能明顯減少動脈粥樣硬化的發(fā)生?；诖?本研究將APO-AI和SR-BI基因作為治療動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的治療基因。 目前基因治療載體可分兩大類：病毒載體和非病毒載體。陽離子脂質(zhì)體(cationic liposomes,CL)是目前用于基因治療的研究最廣泛的非病毒類載體之一,具有毒性低、轉(zhuǎn)移的核苷酸大小范圍廣(從寡核苷酸到人工染色體均可)、制備方法較簡單等優(yōu)點。但是該載體仍存在轉(zhuǎn)染效率較低、靶向性差等問題。因

3、此,提高CL的靶向性是當前基因載體研究的重要發(fā)展方向之一。為提高CL的靶向性,本研究將磁靶向給藥系統(tǒng)的原理引入CL介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染中,即制備磁性陽離子脂質(zhì)體(Magnetic cationic liposomes,MCL)。通過在脂質(zhì)體中摻入一定數(shù)量、-定粒徑的磁性納米粒子,利用體外磁場的效應(yīng)可以引導(dǎo)MCL/DNA復(fù)合物在體內(nèi)定向移動和定位集中,從而達到在靶組織目的基因高效靶向表達的效果。本研究制備得到磁性陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物,通過

4、體外細胞實驗及大鼠體內(nèi)靶向性實驗驗證了其用于提高陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的靶向性從而提高轉(zhuǎn)染效率的可行性,還通過大鼠體內(nèi)的初步藥效學(xué)實驗驗證其用于磁性靶向治療動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的可行性。 本研究將大鼠Apo-AI、SR-BI基因以及蟲熒光素酶(luciferase)報告基因克隆到真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中,分別構(gòu)建重組成pcDNA3.1(+)/APO-AI、pcDNA3.1(+)/SR-BI和pcDNA-CMV lucif

5、erase表達質(zhì)粒。由此構(gòu)建成的表達載體可以在哺乳動物細胞中高效表達。還通過酶解和測序鑒定了三種質(zhì)粒的準確性。 本研究建立了鄰菲噦啉法測定鐵含量,以吸收度A為縱坐標,以濃度C(μg/mL)為橫坐標進行線性回歸,得到直線方程為:A=0.0198C-0.0072,r=0.9999。結(jié)果表明,濃度在5-30 μg/mL,的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。低、中、高濃度下的回收率、精密度均符合方法學(xué)要求。本研究以二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)以及3

6、β-[N-(N',N'-二甲氨基乙基)]氨甲酰基-膽固醇(DC-Chol)為脂質(zhì)體的脂質(zhì)成分,并采用逆相蒸發(fā)法制備磁性陽離子脂質(zhì)體(MCL)。通過單因素考察確定MCL的制備條件為：有機溶劑選擇體積比1:9的氯仿/乙醚混合溶劑；油水相體積比4:1;pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)作分散介質(zhì)；α-生育酚用量為磷脂質(zhì)量的1％；采用輻射滅菌法對脂質(zhì)體除菌。本研究采用紫外分光光度法建立了質(zhì)粒DNA含量測定方法,以紫外吸收強度A為縱坐標,以濃度

7、C(μg/mL)為橫坐標進行線性回歸,得到直線方程為:A=0.0207C+0.0009,r=0.9999。結(jié)果表明,濃度在1.25-20μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。采用低溫高速離心法測定DNA包封率,回收率實驗符合要求。 對復(fù)合物進行瓊脂糖凝膠電泳考察形成穩(wěn)定復(fù)合物所需的最低DC-Chol/DNA質(zhì)量比值為2?？疾炝薉C-Chol/DNA質(zhì)量比對MCL/DNA復(fù)合物的粒徑、zeta電位以及DNA包封率的影響,實驗結(jié)果表明DC

8、-Chol/DNA質(zhì)量比值大于等于9時制得的復(fù)合物結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,DNA包入囊泡中可有效被保護從而保證較高的轉(zhuǎn)染效率,因此本研究優(yōu)選了DC-Chol/DNA質(zhì)量比為9的復(fù)合物,用于后面的動物實驗部分。并對優(yōu)化后的MCL/DNA復(fù)合物進行了相關(guān)性質(zhì)的考察：用透射電子顯微鏡觀察復(fù)合物的形態(tài)并對其進行能譜分析,結(jié)果表明制得的復(fù)合物內(nèi)含有磁性物質(zhì)及DNA;用納米粒度及電位分析儀測得復(fù)合物的粒徑為343.4nm,多分散系數(shù)0.231,符合預(yù)期要求,復(fù)

9、合物的zeta電位為+37.5mV,體系穩(wěn)定性較好；復(fù)合物中DNA的包封率為79.5％；體外磁場響應(yīng)性能考察則表明復(fù)合物保留了磁性脂質(zhì)體的良好的磁場相應(yīng)性能。 本研究采用MTT法測定不同的鐵含量的MCL以及CL對人正常肝細胞(THLE-3)的毒性,結(jié)果表明鐵含量為80μg/mL的MCL,對細胞的毒性與CL相似,均不大,細胞存活率均在80％以上。結(jié)果還表明當DC-Chol/DNA的質(zhì)量比≥15時各組制劑均表現(xiàn)出一定的細胞毒性,且當

10、鐵含量達到176.5μg/mL時,細胞毒性作用較80μg/mL,組有明顯增大(P<0.05)。由于細胞的轉(zhuǎn)染與細胞的狀態(tài)有較大關(guān)系,因此本實驗選擇鐵含量為131.6μg/mL和80μg/mL的MCL進行進-步的細胞轉(zhuǎn)染實驗,且各組制劑的DC-Chol/DNA的質(zhì)量比均選擇在≤10。 本研究用重新構(gòu)建的pcDNA-CMV luciferase質(zhì)粒作報告基因,優(yōu)化了MCL與CL在THLE-3中的轉(zhuǎn)染條件并比較了在最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件下MCL

11、(加外加磁場與自然條件下)與CL的轉(zhuǎn)染效率。MCL的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件為DC-Chol/DNA質(zhì)量比為5,MCL/DNA復(fù)合物與細胞的作用時間為8h,外加磁場的作用時間為30min。CL的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件為DC-Chol/DNA質(zhì)量比為2.5,CL/DNA復(fù)合物與細胞的作用時間為8h。最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件下,自然條件下的MCL的轉(zhuǎn)染效率與CL無差別,但是在外加磁場的作用下,MCL在THLE-3細胞中轉(zhuǎn)染效率較CL提高了2.6倍(P<0.01)。

12、本研究對MCL/DNA復(fù)合物在大鼠體內(nèi)的靶向性進行了初步研究。大鼠尾靜脈注射MCL/DNA復(fù)合物,在其肝部固定釹鐵硼永磁鐵進行磁場導(dǎo)向,24h后測定報告基因在心、肝、脾、肺、腎中的表達情況。其中,在肝臟中的表達結(jié)果表明,MCL/DNA復(fù)合物有外加磁場誘導(dǎo)下(+)的熒光素酶的表達分別為自然條件下(-)及CUDNA復(fù)合物的1.5倍(P<0.01)和2.7倍(P<0.01)。 本研究以APO-AI和SR-BI作為治療基因,MCL為基因

13、載體并加以磁場導(dǎo)向,對大鼠動脈粥樣硬化模型進行基因治療的初步研究。血脂測定結(jié)果表明,與對照組比較,可見6周后各基因治療組的血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)明顯下降(P<0.01),高密度脂蛋白(HDL)明顯升高(P<0.01)。病理學(xué)大體標本的觀察結(jié)果顯示各基因治療組動脈粥樣硬化斑塊減小,部分血管管壁變?nèi)彳?彈性恢復(fù),管腔內(nèi)膜變光滑,血管管壁增厚不明顯。經(jīng)油紅O染色的病理學(xué)觀察顯示：血管內(nèi)膜表面不規(guī)則的紅色

14、隆起減少,基因治療組-脂質(zhì)條紋面積和纖維斑塊面積的百分比分別為9.21％和1.16％,組二分別為9.20％和1.18％。鏡下觀察結(jié)果顯示內(nèi)皮細胞增生減弱,纖維膜下可見少量泡沫細胞聚集。對照組血管管壁仍明顯僵硬增厚,血管內(nèi)膜表面多發(fā)不規(guī)則的紅色隆起,脂質(zhì)條紋面積和纖維斑塊面積的百分比分別為32.25％和1.66％。鏡下顯示內(nèi)皮細胞增生明顯,纖維膜下可見大量泡沫細胞聚集,斑塊突向管腔,呈典型的脆性斑塊表現(xiàn)。以上血脂測定結(jié)果以及病理結(jié)果均可說