重組蛇毒纖溶酶rFⅡ抗脂多糖誘導的兔彌散性血管內凝血的作用及機制研究.pdf

1、彌散性血管內凝血(Disseminatedintravasxularcoagulation，DIC)是指以不同原因所致喪失局限性的血管內凝血系統(tǒng)激活為特征的獲得性綜合征。DIC的病理生理特征主要是機體凝血系統(tǒng)及纖維蛋白溶解系統(tǒng)相繼或同時啟動，導致血小板聚集、活化及釋放，凝血因子消耗，彌散性血管內特別是毛細血管內纖維蛋白沉積。感染性疾病是導致DIC最常見、最重要的病因之一，其發(fā)病率在DlC常見病因中居于首位。感染性疾病并發(fā)DIC，由于纖維

2、蛋白的沉積及廣泛的微血栓形成，極易導致多器官功能衰竭，病死率高達70％以上。但是，目前臨床的治療DIC手段有限。肝素是當前DIC抗凝治療的基本藥物。然而，動物和臨床資料表明，肝素雖能有效地阻斷內毒素引起的DIC過程，但并不能防止多器官功能衰竭和死亡的發(fā)生。且肝素使用不當容易造成自發(fā)性出血。而抗凝血酶、水蛭素、活性蛋白C等抗凝藥物用于治療DIC還處于臨床起步試驗階段，需要大規(guī)模的臨床實驗來證實它們的療效。而且它們的出血傾向十分嚴重，臨床上

3、在DIC治療中的應用也是很謹慎的。 雖然溶栓療法用于DIC的治療還處于探索階段，但越來越多的學者認為在早期減少微血栓的形成有可能成為臨床治療DIC、開發(fā)新的治療藥物的新思路。重組蛇毒纖溶酶(recombinantfibrinogenaseFII，rFII)是本實驗室用基因工程的方法自行研制的新型溶栓藥。本課題組前期的研究工作證實，rFII對纖溶酶原沒有激活作用，而是直接作用于纖維蛋白，水解纖維蛋白，發(fā)揮溶栓作用。藥物進入體內溶栓

4、的特異性強，由于對纖溶酶原沒有激活作用，因此對凝血系統(tǒng)的干擾少。 研究目的： 1、研究重組蛇毒纖溶酶rFII對脂多糖誘導的兔彌散性血管內凝血的作用。 2、探討重組蛇毒纖溶酶rFII抗脂多糖誘導的兔彌散性血管內凝血的作用機制。 3、為重組蛇毒纖溶酶rFII的開發(fā)和利用提供實驗依據(jù)。 方法及結果： 1、重組蛇毒纖溶酶rFII的制備用基因工程的方法，構建了重組蛇毒纖溶酶rFII的表達質粒，在真核

5、表達系統(tǒng)酵母菌中獲得高效表達。經(jīng)過westernblot檢測，證明了重組的蛇毒纖溶酶rFII與天然的蛇毒纖溶酶高度同源，其純度達到SDS-PAGE單一條帶。通過離子交換和疏水層析，最終獲得了高純度的重組蛇毒纖溶酶rFII。純化的重組蛇毒纖溶酶rFII通過激光飛行時間質譜分析，其質譜峰單一，其分子量大小為27.4kDa。我們對重組蛇毒纖溶酶rFII進行了HPLC分析，結果與質譜的結果相一致，表明了重組蛇毒纖溶酶rFII是一個成分單一的高純

6、度重組蛋白。 2、重組蛇毒纖溶酶rFII對脂多糖誘導的兔彌散性血管內凝血的作用采用JoseHermida等的方法建立兔DIC模型。脂多糖(LPS)以100μg/kg/h的速度從兔的一側耳緣靜脈滴注，同時對側耳緣靜脈給相應藥物。實驗分為6組：正常對照組、DIC模型組、低劑量rFII治療組(O.025mg/kg/hrFII)、中劑量rFII治療組(0.05mg/kg/hrFII)、高劑量rFII治療組(0.1mg/kg/hrFII)

7、、肝素治療組。在給藥前和給藥2、6小時后分別予以動脈取血，測定血液活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、血小板計數(shù)及纖維蛋白原的變化情況；分離血漿，測定給藥前和給藥后2、6小時的血漿的ALT、BUN水平。實驗24h后處死動物，取。腎臟與肝組織，做HE染色及纖維素染色，在光鏡下觀察各臟器組織的變化情況以及纖維蛋白血栓形成情況。觀察實驗兔24小時內生存率。 結果表明：動物給予LPS后，出現(xiàn)呼吸加速及呼吸困難，DIC

8、模型組兔24小時生存率為38.5％；給予低、中、高劑量rFII治療組動物在實驗過程中生命體征比較平穩(wěn)，呼吸加速及心率增快明顯改善，其24小時生存率分別為58.3％、80.0％和78％。DIC模型組兔靜注LPS后，大量血小板與凝血因子被活化，血小板被消耗；纖維蛋白原進行性下降；PT、APTT延長。重組蛇毒纖溶酶rFII組(尤其是高劑量rFII組)的能抑制LPS誘導的纖維蛋白原進行性下降和PT、APTT延長。DIC模型組兔血漿ALT和BUN

9、水平6小時均迅速升高。重組蛇毒纖溶酶rFII治療組血漿中ALT和BUN的水平明顯降低。DIC模型組兔的肝臟、腎臟均可見纖維蛋白血栓形成。rFII各劑量治療組和肝素治療組的肝臟、腎臟組織光鏡下血管內未見明顯血栓形成。HE染色顯示DIC模型組兔肝臟門管區(qū)明顯淤血，大量炎性細胞浸潤及Kupffer氏細胞增生，肝小葉結構破壞，有較多點狀或片狀出血灶，肝竇及中央靜脈淤血。rFII各劑量治療組和肝素治療組肝組織的炎癥細胞的浸潤較對照組有不同程度減少

10、；肝臟門管區(qū)及肝竇及中央靜脈的淤血亦明顯減少；肝小葉結構也較為正常。腎臟組織HE染色顯示DIC模型組兔腎皮質和腎小球缺血性壞死及腎間質水腫，rFII各劑量治療組和肝素治療組腎臟損傷情況明顯減弱。 3、重組蛇毒纖溶酶rFII體內、外溶栓作用采用肺血栓模型觀察重組蛇毒纖溶酶rFII的體內溶栓作用。實驗分為6組：生理鹽水組，1.0、0.3、0.1和0.03mg/kg重組蛇毒纖溶酶rFII組、尿激酶組。生理鹽水組兔肺血栓的濕重為24.8

11、±1.6mg，其干重為6.0±0.3mg。尿激酶組兔肺血栓的濕重為18.0±1.3mg，其干重為4.9±0.2mg。給予1.0、0.3、0.1和0.03mg/kgrFII1小時后，兔肺血栓的濕重分別為12.6±1.5mg、14.7±1.5mg、18.3±1.1mg和20.1±1.6mg。其血栓的干重分別為3.5±0.4mg、4.0±0.3mg、4.9±0.2mg和5.2±0.2mg。與生理鹽水組相比，有明顯的溶栓作用。1.0、0.3mg

12、/kgrFII溶栓作用要強于10萬U/kg的尿激酶。且rFII對兔肺血栓的溶栓作用呈劑量依賴性。 用纖維蛋白平板法和血平板法測定重組蛇毒纖溶酶的體外溶栓作用。不同濃度的rFII對纖維蛋白的降解作用呈劑量和時間依賴性；在30分鐘時，rFII降解纖維蛋白的作用較t-PA明顯。在滅活標準纖維平板上，rFII對纖維蛋白的降解作用呈劑量和時間依賴性，而t-PA在滅活的纖維蛋白平板沒有作用。rFII對兔血平板纖維蛋白的降解作用呈劑量和時間依

13、賴性；在30分鐘時，rFII降解纖維蛋白的作用較t-PA明顯。在滅活兔血平板上，rFII對纖維蛋白的降解作用呈劑量和劑量依賴性，而t-PA在滅活的兔血平板沒有作用。 4、重組蛇毒纖溶酶rFII體內、外降解腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的作用用ELISA法檢測各組兔血漿中TNF-α的水平。將人、兔、鼠的TNF-α蛋白加入rFII(10μg/ml)在37℃溫育1小時。進行SDS-PAGE電泳觀察反應產(chǎn)物的生成情況。用Westernb

14、lot法和免疫熒光檢測巨噬細胞TNF-α的表達；用ELISA法檢測培養(yǎng)巨噬細胞上清中TNF-α的表達；RT-PCR方法檢測巨噬細胞中TNF-αmRNA水平的變化。 5、重組蛇毒纖溶酶rFII底物特異性的研究將各種重組人血漿蛋白fibrinogen、albumin、γ-globulin、transferrin、antitrypsin、lgA、α2-macroglobulin、haptoglobin、laminin、compleme

15、nt3、complement5、complent6、complent9加入重組蛇毒纖溶酶rFII(10μg/ml)在37℃溫育2小時。用SDS-PAGE觀察反應產(chǎn)物的生成情況。測定rFII的半數(shù)致死量。 結論： 1、重組蛇毒纖溶酶rFII顯著提高脂多糖誘導兔DIC的生存率。rFII抑制脂多糖誘導的彌散性血管內凝血兔血漿的ALT、BUN的升高。 2、rFII能有效溶解兔肺血栓。rFII對纖維蛋白的降解呈時間和劑量依

16、賴性。rFII對纖維蛋白有直接降解作用，該作用不依賴于纖溶酶原。 3、重組蛇毒纖溶酶rFII能降低脂多糖誘導的兔血漿TNF－α水平。重組蛇毒纖溶酶rFII對TNF－α蛋白有直接降解作用。 4、重組蛇毒纖溶酶rFII對部分血漿蛋白如白蛋白、抗胰蛋白酶、結合珠蛋白、lgA、轉鐵蛋白、層粘連蛋白沒有明顯的降解作用。有一定的底物特異性。 5、rFII的半數(shù)致死量(LD50)為53.5mg/kg；95％可信限為48.1～5