重組五步蛇毒纖溶酶Ⅱ對大鼠重癥急性胰腺炎的作用.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是由多種因為引起胰酶在胰腺內被激活而導致的以胰腺局部炎癥反應為主、伴或不伴其它器官功能改變的疾病。AP通常有自限性,但約20％的病例會發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe AP,SAP),出現(xiàn)胰腺壞死和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。SAP死亡率在30％～50％,而且自上世紀70年代以來并沒有明顯降低。由于死亡

2、率高,病理生理機制不清,缺乏切實有效的特異性療法,SAP仍然是臨床上的一大難題。
　　 盡管SAP的確切機制尚未完全闡明,但大量促炎因子分泌入血和隨后形成的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)被認為是SAP致死的主要因為。其中,腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)是首要的促炎因子,在SIRS中居于核心地位,對

3、SAP多器官損傷和病人死亡起著關鍵作用。很多證據(jù)表明,抗TNF-α治療在實驗性胰腺炎中具有保護作用。
　　 重組纖溶酶Ⅱ(recombinant fibrinogenaseⅡ,rFⅡ)是本實驗室從五步蛇(學名:尖吻蝮蛇,Agkistrodon Acutus)毒腺表達型cDNA文庫中表達純化的基因重組溶栓藥。它在體外能降解纖維蛋白和TNF-α,在敗血癥和彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coa

4、gulation,DIC)動物模型上均有保護作用?；赥NF-α在SAP中的重要作用和rFⅡ降解TNF-α的前期實驗,本論文用rFⅡ治療SAP動物模型并在體外進一步確認rFⅡ對TNF-α的作用。
　　 方法：
　　 用經(jīng)膽胰管逆行灌注5％牛磺膽酸鈉的方法,在雄性SD大鼠上建立SAP模型。大鼠隨機分成四組:對照(control,Con)組:膽胰管灌注生理鹽水,靜脈注射生理鹽水；模型(SAP)組:膽胰管灌注5％牛磺膽酸鈉,靜

5、脈注射生理鹽水；rFⅡ治療(rFⅡ)組:膽胰管灌注5％牛磺膽酸鈉,靜脈注射rFⅡ(1mg/kgBW)；Infliximab治療(Inf)組:膽胰管灌注5％牛磺膽酸鈉,靜脈注射Infliximab(8mg/kg BW)。給藥起始時間為病程的0.5h,總時程約3h。
　　 觀察各組大鼠24h內的存活情況。
　　 取0、3、6、9、12h的大鼠血清樣品,用碘-淀粉比色法測定血清淀粉酶活性,用ELISA法檢測TNF-α、白細胞介

6、素(interleukin,IL)-1β、IL-6和IL-10的濃度。
　　 取12h的大鼠胰腺和右肺,測定濕干重比,進行病理切片和病理學評分。取6h的大鼠腹水,測定腹水指數(shù)和腹水TNF-α濃度；分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠腹腔巨噬細胞；用四甲基偶氮唑藍(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法測定各組大鼠腹腔滲出巨噬細胞(peritoneal e

7、xudatemacrophages,PEMs)的相對數(shù)量；測定各組大鼠PEMs培養(yǎng)12h后分泌的TNF-α和IL-1β濃度。
　　 在胰腺炎相關PEMs模型中,用1ng/ml rFⅡ作用不同時間和用不同濃度的rFⅡ作用1h,觀察rFⅡ對TNF-α和IL-1β分泌的影響。
　　 在胰腺炎相關腹水(pancreatitis-associated ascitic fluid,PAAF)誘導的固有腹腔巨噬細胞(resident

8、peritoneal macrophages,RPMs)模型中,用1μg/ml rFⅡ作用3h,觀察rFⅡ對TNF-α和IL-1β分泌的影響。
　　 在體外,將0.1μg rFⅡ分別與2.5μg人TNF-α、小鼠TNF-α和大鼠TNF—α在37℃孵育2h,用SDS-PAGE分析產(chǎn)物的情況。
　　 在體外,用不同濃度的rFⅡ與初始濃度為1000pg/ml的大鼠TNF-α和人TNF-α在37℃孵育1h,用ELISA法檢測剩余

9、TNF-α濃度,并繪制量效曲線,計算rFⅡ對兩種TNF-α的半數(shù)抑制濃度(inhibition concentration at50％effect,IC50)。
　　 結果：
　　 rFⅡ治療能夠顯著提高SAP大鼠的生存率(P=0.006),減輕胰腺和肺的損傷,抑制腹腔炎癥,降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的濃度。這些效果與Infliximab相似。
　　 在胰腺炎相關PEMs中,rFⅡ對TN

10、F-α分泌的抑制作用具有時間和濃度依賴性。在PAAF誘導的RPMs模型中,rFⅡ也能抑制TNF-α的分泌。rFⅡ在兩種細胞模型中均對IL-1β的分泌沒有影響。
　　 在37℃孵育2h,0.1μg rFⅡ能將2.5μg人TNF-α和小鼠TNF—α完全降解,但不能完全降解2.5μg大鼠TNF-α。在37℃孵育1h,rFⅡ對1000pg/ml大鼠TNF—α的IC50為269.0(244.7～295.8)pg/ml,對1000pg/ml