重組蛇毒纖溶酶rFⅡ抗超急性排斥反應的作用及機制研究.pdf

1、器官移植已經(jīng)成為治療臟器功能衰竭的一種重要方法，隨著器官移植研究工作的發(fā)展，臨床器官移植需要大量可供移植的器官，供體器官的短缺，成為限制器官移植發(fā)展的主要障礙。不同種屬動物間器官移植重新受到人們的關(guān)注，異種移植被認為是解決人類供體器官短缺的潛在途徑，可能會從根本上解決目前器官移植工作面臨的困難，然而異種移植后將出現(xiàn)比同種異體移植更為復雜的排斥反應———超急性排斥反應(hyperacute rejection，HAR)，是異種器官移植后面

2、臨的第一個，也是最重要的免疫學障礙。超急性排斥反應是由天然存在的抗體及補體介導的，在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生的導致移植物缺血壞死的劇烈反應。異種天然抗體、補體系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞三者被稱為超急性排斥反應的三大障礙，其中補體系統(tǒng)的激活最為關(guān)鍵。目前防治超急性排斥反應的方法主要為天然抗體清除，抑制補體激活以及基因水平進行調(diào)控，均可延緩和/或阻止超急性排斥反應的發(fā)生發(fā)展。但是天然抗體的清除，只能延緩超急性排斥反應的發(fā)生，并不能阻止超急性排斥反應的發(fā)生；基因工程

3、治療，技術(shù)難度大，花費高，仍處于實驗研究的起步階段。 雖然抑制補體激活用于HAR的治療也還是處于探索階段，但由于補體的激活是HAR發(fā)生的關(guān)鍵因素，因而越來越多的學者認為在早期抑制補體激活有可能成為防治HAR、開發(fā)新的治療藥物的新思路。 重組蛇毒纖溶酶(recombinant fibrinogenase FⅡ，rFⅡ)是本課題組用基因工程的方法自行研制的新型溶栓藥。前期的研究工作證實，rFⅡ能高效的溶解血栓，對炎癥因子TN

4、F有降解作用，提示可減輕HAR的病理改變；而且rFⅡ可降解補體C3、C5、C6和C9，提示rFⅡ可通過降解補體防治HAR。 研究目的： 1.研究重組蛇毒纖溶酶rFⅡ?qū)Τ毙耘懦夥磻淖饔茫?2.探討重組蛇毒纖溶酶rFⅡ?qū)Τ毙耘懦夥磻淖饔脵C制。 方法及結(jié)果： 1.重組蛇毒纖溶酶rFⅡ的制備 用基因工程的方法，構(gòu)建了重組蛇毒纖溶酶rFⅡ的表達質(zhì)粒，在真核表達系統(tǒng)酵母菌中獲得高效表達。經(jīng)we

5、stern blot檢測，證明了重組蛇毒纖溶酶rFⅡ與天然的蛇毒纖溶酶高度同源，其純度達到了SDS—PAGE單一條帶。通過離子交換和疏水層析，最終獲得了高純度的重組蛇毒纖溶酶rFⅡ。純化的重組蛇毒纖溶酶rFⅡ通過激光飛行時間質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜峰單一，其分子量大小為27.4KDa。對重組蛇毒纖溶酶rFⅡ進行HPLC分析，結(jié)果與質(zhì)譜的結(jié)果一致，表明了重組蛇毒纖溶酶rFⅡ是一個成分單一的高純度重組蛋白。 2.重組蛇毒纖溶酶rFⅡ體內(nèi)外降

6、解補體的作用 將補體C3.C5.C6、C9分別與重組蛇毒纖溶酶rFⅡ混勻在37℃溫育2h，用SDS—PAGE觀察反應產(chǎn)物的結(jié)果；將不同劑量的rFⅡ與大鼠血漿混勻，在37℃溫育2、6、12h，再進行CH50測定，觀察其補體活性的變化；從大鼠的股靜脈滴注低、中、高劑量的rFⅡ，用ELISA法檢測各組大鼠血漿中的補體C1q、C3、C4的水平。 結(jié)果表明：10μg/ml的rFⅡ在37℃溫育2h，對補體蛋白C3、C5、C6、C9有

7、降解作用；10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的rFⅡ與大鼠血漿在37℃預溫育2、6、12h，能顯著降低補體活性；從大鼠股靜脈滴注低、中、高劑量的rFⅡ，能顯著的降低補體C1q、C3、C4的含量。 3.重組蛇毒纖溶酶rFⅡ在人血漿灌注大鼠離體心臟的超急性排斥反應中的作用 采用Langdorff離體器官灌注系統(tǒng)，建立人血漿灌注大鼠離體心臟的超急性排斥反應模型。觀察重組蛇毒纖溶酶rFⅡ?qū)θ搜獫{灌注大鼠離體心臟的超急

8、性排斥反應的作用。實驗分為6組：K—H空白對照組，人血漿灌注組，人滅活補體血漿灌注組，rFⅡ分三個劑量組：10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml。進行血流動力學測定，血漿補體含量的測定以及觀察離體大鼠心臟的存活時間。 結(jié)果表明：在人血漿灌注組，大鼠心臟的心率迅速下降，LVDP迅速下降，大鼠離體心臟的存活時間僅為15.94±4.75min，C1q、C3、C4的含量也明顯下降(p<0.05)，標志超急性排斥反應的發(fā)生。在補體

9、滅活血漿灌注組，大鼠心率，及LVDP緩慢下降，與緩沖液組無明顯差異，大鼠離體心臟的存活時間為94.62±23.91 min，血漿補體含量的變化也沒有統(tǒng)計學意義的差異。rFⅡ灌注組中，大鼠心率，及LVDP緩慢下降(與人血漿灌注組比較，P<0.05)，血漿中的補體含量在實驗前也顯著的下降(P<0.05，與人血漿灌注組比較)，離體大鼠心臟其生存時間均不同程度的增加(與人血漿灌注組比較，P<0.05)；尤其是高劑量組的rFⅡ組，其補體含量的下降

10、至很低的水平，在離體大鼠心臟在體外灌流前后，補體C1q、C3、C4的含量均無明顯變化，存活時間也提高至92.36±16.63min。這提示了，高劑量的rFⅡ可使補體含量降至較低的水平，從而并不會引起補體的激活。 4.重組蛇毒纖溶酶rFⅡ在豚鼠一大鼠異種心臟移植的超急性排斥反應中的作用 參考Ono氏方法，將豚鼠心臟異位移植于大鼠腹部，建立豚鼠一大鼠異種心臟移植的超急性排斥反應的模型。實驗分為4組： HAR陽性對照組；低、中

11、、高劑量rFⅡ組(分別為0.1mg/kg/h、0.2mg/kg/h、0.5mg/kg/h)。記錄從血流恢復供心復跳至供心完成停止跳動的時間；在心臟移植前及供心完成停止跳動時，取動脈血，檢測血漿中補體C1q、C3、C4的含量；移植心臟停止跳動后，供體心肌用10％甲醛固定，常規(guī)HE染色及補體C3的免疫組化檢查。 結(jié)果表明：在心臟移植手術(shù)后，HAR對照組供心其存活時間僅為0.32±0.12h，肉光鏡下病理檢查發(fā)現(xiàn)，心肌細胞壞死，有炎性

12、細胞浸潤，間質(zhì)出血伴血小板血栓，免疫組織學分析顯示，補體成分廣泛沉積于心臟血管內(nèi)皮細胞膜。ELISA檢測，受體血清補體C1q、C3、C4的含量均顯著的下降。以上提示了本組供心已發(fā)生了劇烈的超急性排斥反應，供心迅速死亡。 在rFⅡ給藥組中，由于在移植前受體的補體含量已下降至較低的水平，從而抑制了補體激活，使供心的生存時間均明顯的增加，病理檢查發(fā)現(xiàn)，供心損傷程度比HAR陽性對照組有明顯的減弱。細胞水腫程度有不同程度的減輕，血栓也明顯

13、的減少，甚至消失，心肌細胞的壞死也不同程度的下降，仍可見完整的心肌細胞。尤其是高劑量組的rFⅡ組，其補體含量的下降至很低的水平，在異種心臟移植前后，補體C1q、C3、C4的含量均無明顯變化，存活時間也提高至12.92±3.31h，免疫組化可見，僅有少量的補體C3附著于心臟血管內(nèi)皮細胞膜，尤其在大劑量組中，幾乎未見補體C3附著于心臟血管內(nèi)皮細胞膜。這說明了，由于重組蛇毒纖溶酶rFⅡ可以明顯的降低血漿中的補體，可以有效的延緩和/或抑制超急性

14、排斥反應，顯著地提高供心的生存時間。 5.重組蛇毒纖溶酶rFⅡ降解膜攻擊復合物(MAC)的作用 將HUVECs細胞與不同劑量的重組蛇毒纖溶酶rFⅡ在37℃孵育1h。觀察rFⅡ?qū)UVECs細胞活性的影響。HUVECs細胞分別與不同劑量的C56和C7，C8，C9在37℃孵育從而在HUVECs細胞膜表面組裝MAC，檢測上清中乳酸脫氫酶(lactatedehy drogenase，LDH)的含量，判斷MAC沉積對細胞膜完整性的

15、影響。建立MAC亞溶破HUVECs細胞模型，實驗分4組，空白對照組，rFⅡ預先給藥低劑量組(1μg/ml)，rFⅡ預先給藥高劑量組(10μg/ml)，rFⅡ給藥組(10μg/ml)。用激光共聚焦法觀察重組蛇毒纖溶酶rFⅡ降解MAC的作用。 結(jié)果表明：1，5.0，10μg/ml的rFⅡ不影響HUVECs細胞活性。而20μg/ml的rFⅡ則使HUVECs細胞活性下降。在C56用量≤1.0μg/孔時；上清中LDH的釋放較少(<10％)

16、說明此時細胞溶破發(fā)生很少，當C56用量>1.0μg/孔時，細胞LDH釋放明顯增多，說明細胞膜的完整性可能受到破壞；將C56與后續(xù)的補體成分一起與HUVECs孵育組裝MAC，激光共聚焦顯微鏡觀測，可見細胞膜表面有大量的MAC沉積；將1μg/ml、10μg/ml的重組蛇毒纖溶酶rFⅡ預先與補體C56、C7、C8、C9，37℃孵育，再進行MAC體外組裝。激光共聚焦顯微鏡觀測，可見細胞膜表面有的MAC沉積有不同程度的消失，在大劑量重組蛇毒纖溶酶

17、rFⅡ組中，幾乎未見MAC沉積。而將10μg/ml的重組蛇毒纖溶酶rFⅡ與已附有MAC的HUVECs細胞在37℃孵育1h后，用激光共聚焦顯微鏡觀測，仍可見細胞膜表面有大量的MAC沉積。 結(jié)論： 1.重組蛇毒纖溶酶rFⅡ能降低人血漿補體C1q、C3、C4的含量；降低CH50活性，降解補體C3、C5、C6、C9。 2.重組蛇毒纖溶酶rFⅡ顯著提高人血漿灌注離體大鼠心臟的HAR的存活時間；rFⅡ能迅速恢復人血漿灌注離體