利用LAMP技術從中間宿主中快速檢測華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis).pdf

1、華支睪吸蟲?。–lonorchiasis）又稱肝吸蟲病，是由華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）感染引起的一種人獸共患病。華支睪吸蟲病主要分布在越南北部、韓國和中國的大部分地區(qū)。在我國主要流行于廣東、廣西、黑龍江、吉林和遼寧等省，共有27個省、市和自治區(qū)有本病流行或病例報告。初步估計全球感染人數(shù)為1500萬人。 華支睪吸蟲主要寄生于人體肝內二級以上分支的膽管內，嚴重感染時也會寄生于膽囊、總膽管甚至胰管內。成蟲的機

2、械性損傷和分泌排泄物是主要的致病因素。已經(jīng)有確切證據(jù)證明與華支睪吸蟲有關的疾病包括有膽管炎、膽囊炎、膽石癥、肝硬化、肝膽管癌、兒童生長發(fā)育障礙、消化性潰瘍、胰腺炎和糖尿病等。2009年3月在法國里昂召開的世界衛(wèi)生組織會議首次確定華支睪吸蟲致肝膽管癌證據(jù)充分。 目前用于華支睪吸蟲中間宿主感染診斷的主要方法是病原生物學檢查，即直接解剖或者借助一定工具和技術觀察中間宿主中是否存在華支睪吸蟲來加以確定。但是病原生物學檢測方法不僅需要有豐

3、富寄生蟲分類學知識的專業(yè)人員操作，而且需要特定的儀器和設備，并且費時、費力、繁瑣、檢出率不高，因此不適宜用于大規(guī)模的流行病普查。 環(huán)介導的等溫核酸擴增檢測技術（Loop—mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年新發(fā)展的一個快速高效、高特異性的核酸擴增技術。該技術采用與PCR不同的DNA聚合酶，結合特殊設計的3組引物，能在短時間內得到檢測對象的反應結果，并能將反應結果以不同形式（電

4、泳、沉淀、顏色變化）表現(xiàn)出來。LAMP技術以其特有的經(jīng)濟、靈敏、快速、便捷、特異性高等優(yōu)點在出現(xiàn)后迅速被廣泛研究用于病毒、細菌及寄生蟲的檢測領域。本研究目的在于發(fā)展一種可以從中間宿主中快速檢測華支睪吸蟲的LAMP技術，從而填補在現(xiàn)場普查和快速診斷領域分子診斷技術的空白。 本研究基于華支睪吸蟲ITS2序列設計了包括環(huán)引物在內的6條特異性引物組，建立了利用LAMP技術檢測華支睪吸蟲的反應體系。結果顯示：在Bst DNA聚合酶作用下，

5、反應溫度60度（恒溫），反應時間60分鐘為華支睪吸蟲基因組DNA的最佳LAMP擴增條件。 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測LAMP對華支睪吸蟲基因組DNA的靈敏度，可達10 fg/μl，比傳統(tǒng)PCR的靈敏度高3個數(shù)量級。在相同條件下，通過對華支睪吸蟲及其他寄生蟲（大片吸蟲（Fasciola gigantica）、肝片吸蟲（Fasciola hepatica）和日本血吸蟲（Schistosoma japonicum））以及中間宿主草魚（Ct

6、enopharyngodon idellus）進行LAMP擴增，顯示了本研究設計的引物組具有高度的特異性。 運用LAMP和傳統(tǒng)PCR同時檢測陽性和陰性樣本，結果顯示LAMP檢測結果與PCR基本一致，且能檢測出PCR不能檢測到的陽性螺樣本。運用LAMP和傳統(tǒng)PCR同時檢測華支睪吸蟲病流行區(qū)采集的107份螺，魚以及蝦類樣本，結果表明傳統(tǒng)PCR檢測的陽性率為16.8％（18/107），LAMP檢測的陽性率為27.1％（29/107）。