LAMP技術(shù)在東方蜜蜂微孢子蟲檢測中的應(yīng)用.pdf

1、蜜蜂在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)維護方面起著舉足重輕的作用。然而，由蜜蜂微孢子蟲寄生引起的蜜蜂微粒子病致使蜂群采集力下降甚至毀滅整個蜂群，因此，建立簡單快速鑒別蜜蜂微孢子蟲的方法，對蜜蜂產(chǎn)業(yè)具有重大意義。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是基于靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件反應(yīng)1h即可完成核酸擴增。
　　為了提高蜜蜂微粒子病

2、檢測的靈敏度和適用性，利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，以從重慶酉陽分離的東方蜜蜂微孢子蟲（Nosema ceranae）為研究對象，針對其16S rDNA的6個不同片段設(shè)計4種特異性引物，采用鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在60℃恒溫條件下反應(yīng)60min以檢測東方蜜蜂微孢子蟲。本研究對LAMP技術(shù)在蜜蜂微孢子蟲的檢測進行了探索，建立了快速簡便地檢測東方蜜蜂微孢子蟲的LAMP體系，與常規(guī)PCR相比，具有高靈敏度、高特異性，并在無特殊儀器設(shè)備的條

3、件下即可完成檢測任務(wù)，為廣大養(yǎng)蜂場及時發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲提供了有力的檢測工具，為東方蜜蜂微孢子蟲的防控提供依據(jù)。具體研究結(jié)果如下：
　　1．東方蜜蜂微孢子蟲的LAMP引物設(shè)計及其反應(yīng)條件的優(yōu)化
　　本研究以從重慶酉陽分離到的東方蜜蜂微孢子蟲（N. ceranae）為研究對象，對N. ceranae的16S rDNA基因、ptp2基因swp12基因序列進行引物設(shè)計以及最佳引物的篩選。對三組引物進行實驗驗證后，選定16S rD

4、NA基因作為檢測靶標(biāo)。然后東方蜜蜂微孢子蟲的基因組 DNA作為模板，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19-T-Nc16S rDNA，并將其作為LAMP檢測的陽性對照。為了確立最佳反應(yīng)條件，我們以重組質(zhì)粒pMD19-T-Nc16S rDNA為模板，對LAMP反應(yīng)的溫度、時間、反應(yīng)體系中一對內(nèi)引物FIP/BIP的濃度及Bst DNA聚合酶的用量進行優(yōu)化。結(jié)果表明，LAMP反應(yīng)的最佳條件是內(nèi)引物FIP/BIP的濃度為5μmol/L，聚合酶的用量為80

5、0 U，在60℃反應(yīng)一小時。
　　2. LAMP技術(shù)在東方蜜蜂微孢子蟲檢測中的特異性和靈敏度
　　為了檢測我們設(shè)計的LAMP實驗是否能特異的檢測東方蜜蜂微孢子蟲，我們以蜜蜂常見的病原體球囊菌以及中蜂囊狀幼蟲病毒作為東方蜜蜂微孢子蟲的對照，進行 LAMP檢測。實驗結(jié)果顯示，只有東方蜜蜂微孢子蟲基因組 DNA為模板時能夠擴增出梯形條帶，而其他模板均未擴增出條帶，這一結(jié)果說明本檢測體系具有較高的特異性，可以特異檢測東方蜜蜂微孢子蟲

6、。
　　為了測定LAMP檢測東方蜜蜂微孢子蟲的靈敏度，以重組質(zhì)粒和東方蜜蜂微孢子蟲基因組DNA作為模板分別進行LAMP和常規(guī)PCR檢測，實驗結(jié)果顯示，對于重組質(zhì)粒pMD19-T-Nc16S rDNA，LAMP能檢測到的最低濃度為1.735×10-2ng/μL，PCR能檢測到的最低濃度為1.735×10-1ng/μL。對于東方蜜蜂微孢子蟲基因組DNA，LAMP能檢測到的最低濃度為1.475×10-3ng/uL，PCR能檢測到的最低濃

7、度為1.475×10-1ng/uL，表明LAMP比PCR有更高的檢測靈敏度。
　　3. LAMP技術(shù)對感染東方蜜蜂微孢子蟲的蜜蜂中腸的檢測
　　我們?nèi)∥锤腥镜恼Ｖ心c以及感染不同濃度的N. ceranae的中腸，研磨后進行顯微鏡檢，并提取其基因組DNA，并用LAMP法和常規(guī)PCR法對其基因組進行檢測。結(jié)果顯示，通過顯微鏡檢并對十個視野下觀察到的微孢子蟲數(shù)量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，感染N. ceranae的濃度為105個/mL時，十個視野下

8、可觀察到11個孢子，感染N. ceranae的濃度為104個/mL和103個/mL時，十個視野下都沒有觀察到孢子。LAMP法最低能夠檢測到的孢子濃度為1.2×104個/mL，而常規(guī)PCR法只有陽性質(zhì)粒得到了擴增條帶。因此對于感染了N. ceranae的中腸組織的檢測，LAMP方法的檢測靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR方法的靈敏度。
　　綜上，本文對LAMP技術(shù)在東方蜜蜂微孢子蟲的應(yīng)用進行了研究，結(jié)果顯示，東方蜜蜂微孢子蟲的16S rDNA基