LAMP檢測法用于日本血吸蟲病早期診斷診療效考核的研究.pdf

1、研究表明核酸檢測法用于日本血吸蟲感染家兔血清特異性DNA的檢測具有早期診斷和療效考核價值。本研究成功建立了具有高度敏感性和特異性的LAMP法，并在前期中、高感染度動物模型的研究基礎上，進一步探討LAMP檢測法對日本血吸蟲低感染度家兔模型早期診斷和療效考核的價值，并對LAMP體系進行了優(yōu)化，同時評價了本課題組所建立的3種核酸檢測法應用于日本血吸蟲病患者的診斷及療效考核效果。全文共分為五個部分：
　　 第一部分 LAMP法反應體系的

2、建立及對日本血吸蟲感染家兔血清DNA的檢測
　　 在已建立的兩種PCR法核酸檢測技術的基礎上，本研究進一步建立了一種新型快速、靈敏的核酸檢測法，即環(huán)介導的恒溫擴增法(簡稱LAMP法)，并與兩種PCR法比較檢測的敏感性和特異性，結果表明，LAMP法的敏感性為nested-PCR法的10倍，為普通PCR法的100倍，可擴增出含有1.02個拷貝的質粒DNA，亦未見與曼氏血吸蟲、華支睪吸蟲和旋毛蟲的交叉反應。在日本血吸蟲中高度感染家兔模

3、型的早期診斷和療效考核的實驗中，LAMP法同樣可從感染后第3d的血清中檢測出陽性結果，對療效考核的評價表明LAMP法在治療后第17w時即轉為陰性，與nested-PCR法轉陰時間一致，較PCR法晚1w轉陰，顯示出其具有更高的敏感性。
　　 第二部分 LAMP檢測法反應體系及反應條件的優(yōu)化
　　 對LAMP反應體系的優(yōu)化結果表明，LAMP反應體系最佳內引物濃度為0.96μM，最佳Mg2+濃度為4mM，最佳dNTPs濃度為1

4、.0mM。模板抽提法采用性價比較好的酚氯仿萃取法。向LAMP擴增產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ染料，觀察其顏色改變來判斷擴增結果較在反應體系中加入熒光染料，通過觀察熒光反應來判斷擴增結果更為準確。
　　 第三部分 LAMP檢測法對低感染度日本血吸蟲病早期診斷及療效考核效果的評價
　　 在前期中度感染動物模型實驗研究取得良好效果的基礎上，建立了四組更加符合現(xiàn)場病人實際狀況的低感染度動物模型，進一步評價核酸檢測法特別是LA

5、MP法的實際應用價值。結果顯示三種核酸檢測法均可從四種不同低感染度家兔模型感染后3d及1w～7w的外周血清中擴增到日本血吸蟲特異性DNA片段，尤其是可從感染30條血吸蟲尾蚴的家兔外周血清檢測出特異性DNA片段，其EPG僅為14。對四種不同低感染度日本血吸蟲病家兔模型療效考核的結果表明，LAMP法對感染200條和100條日本血吸蟲尾蚴的家兔均于治療后第14w(感染后21w)血清中的血吸蟲DNA轉為陰性，與nested-PCR的陰轉時間一致

6、，較普通PCR法晚2w轉陰。對感染50條和30條日本血吸蟲尾蚴的家兔血清的檢測結果則顯示，LAMP法于治療后第10w(感染后17w)宿主血清中的血吸蟲DNA轉為陰性，與nested-PCR的陰轉時間一致，較普通PCR法晚1w轉陰。結果表明LAMP法對家兔血清DNA檢測的敏感性與nested-PCR法相當，較普通PCR法高，且療效考核的效果與感染度相關，即感染度越重，血清中血吸蟲DNA轉陰所需時間越長。且LAMP法較普通PCR法和nest

7、ed-PCR法結果更加直觀，無需進行電泳，肉眼即可判斷陽性結果，具有潛在的現(xiàn)場應用前景。
　　 第四部分 LAMP檢測法在日本血吸蟲病患者診斷及療效考核中的應用
　　 對110例糞檢陽性的慢性病人血清DNA的檢測結果表明，LAMP法的陽性率為95.5％(105/110)，nested-PCR法的陽性率為89.1％(98/110)，普通PCR法的陽性率為87.3％(96/110)。對45例非疫區(qū)正常人的檢測結果顯示，普通P

8、CR法、nested-PCR法和LAMP法的特異性均為100％。三種核酸檢測法即普通PCR法、nested-PCR法和LAMP法的陰性預測值(NPV)分別為87.5％、88.9％和95％，陽性預測值(PPV)分別為93.2％，91.6％和91.3％。對47例治療后三個月、六個月和九個月病人血清的檢測結果顯示，三種核酸檢測法的陰轉率均隨治療后時間的延長而增加。LAMP法的陰轉率分別為23.4％，61.7％和83.0％，普通PCR法的陰轉率

9、分別為31.2％，68.1％和89.4％，nested-PCR法的陰轉率分別為27.7％，76.6％和85.1％。而免疫學診斷方法ELISA的陰轉率分別為17.0％，19.1％和25.5％，IHA的陰轉率分別為23.4％，42.5％和31.9％，三種核酸檢測法和兩種免疫學診斷法對治療后九個月病人血清的陰轉率存在顯著差異，P<0.05。
　　 第五部分 LAMP檢測法對不同感染度日本血吸蟲病患者的診斷及療效考核價值
　　

10、對110例慢性病人血清和47例治療后病人血清按照EPG水平進行分類，進一步評價LAMP檢測法對日本血吸蟲病患者的診斷及療效考核價值。檢測結果顯示，LAMP法對高感染度病人血清的陽性檢出率為100％(4/4)，對中感染度的陽性檢出率為92.3％(12/13)，對低感染度的陽性檢出率為95.7％(89/93)。普通PCR法對高中低度病人血清的陽性檢出率分別為100％(4/4)，84.6％(11/13)，86.0％(80/93)，nested

11、-PCR法則分別為100％(4/4)，100％(13/13)和87.1％(81/93)，ELISA分別為100％，84.6％和83.9％，IHA分別為100％，92.3％和91.4％，三種核酸檢測法與兩種免疫學檢測法的陽性檢出率均與感染度相關。LAMP法對47例高、中、低感染度病人血清治療后九個月的陰轉率分別為100％，100％和79.5％，普通PCR法分別為100％，100％和87.2％，nested-PCR法分別為100％，100％

12、和82.1％，兩種免疫學檢測法(ELISA和IHA)均維持在較低水平，陰轉率分別在0％～28.2％和0％～33.3％之間，與核酸檢測法的陰轉率存在顯著差異，P<0.05。
　　 LAMP法的敏感性與nested-PCR相當或稍高，顯著高于普通PCR法，在對療效考核的評價中，與nested-PCR法和普通PCR法具有較好的一致性，kappa值分別為0.604.和0.735。但由于其操作簡便、反應快速、結果直觀、成本低廉，無需昂貴儀