日本血吸蟲中間宿主湖北釘螺遺傳變異及分類的研究.pdf

1、第一部分 第一節(jié)，目的：探討擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)分子標(biāo)記在釘螺遺傳變異研究中應(yīng)用的可能性，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化和引物篩選。方法隨機(jī)抽取云南大理和湖南君山陰性釘螺各1只，用異硫氰酸胍和Resin等抽取DNA，然后用64對(duì)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，熒光檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果每對(duì)引物擴(kuò)增的AFLP標(biāo)記數(shù)在5-55之間，大理釘螺平均每對(duì)引物出現(xiàn)38．30(95％CI36．03～40．

2、57)個(gè)標(biāo)記，君山平均每對(duì)引物擴(kuò)增出39．14(95％CI36．71～41．57)個(gè)標(biāo)記；每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性標(biāo)記數(shù)和多態(tài)性頻率分別在3～37個(gè)和28．6％～76．2％之間，分別平均為23．67(95％CI22．12～25．22)和47．36％(95％CI45．22％～49．50％)結(jié)論：AFLP標(biāo)記技術(shù)能應(yīng)用于湖北釘螺的分類與遺傳多樣性的研究。 第二節(jié)，目的：探討AFLP分子標(biāo)記電泳圖譜信息數(shù)量化數(shù)據(jù)的分析方法。方法隨機(jī)抽取湖

3、南君山陰性釘螺40只，進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，用GlykoBandScan軟件將釘螺AFLP電泳圖譜信息數(shù)量化，使用不同的讀帶標(biāo)準(zhǔn)讀帶，得到相應(yīng)數(shù)據(jù)集，然后對(duì)這些數(shù)據(jù)集進(jìn)行遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)分析與描述性總結(jié)。結(jié)果：不同的標(biāo)準(zhǔn)所得到的遺傳變異結(jié)果均有所差別，但隨著讀帶標(biāo)準(zhǔn)值的增加，反映釘螺種群遺傳多樣性指標(biāo)(如：Shannon’s信息指數(shù))也增加，當(dāng)其增加到一定水平時(shí)，又開始下降，而基因流和基因一致度則剛好相反。不同讀帶標(biāo)準(zhǔn)所得的遺傳變異結(jié)果均呈明顯的

4、正態(tài)分布(P＞0．05)。以總灰度或以總灰度百分比劃分讀帶標(biāo)準(zhǔn)，所得遺傳變異結(jié)果的平均值均十分接近。將采集的釘螺中篩選出40只陰性釘螺，隨機(jī)分為兩組，平均基因一致度在總灰度百分比數(shù)據(jù)中為0．956，在總灰度數(shù)據(jù)中為0．958：兩組間的平均遺傳距離在總灰度百分比數(shù)據(jù)中為0．045，在總灰度數(shù)據(jù)中為0．043。結(jié)論：將電泳圖譜信息數(shù)量化，再以不同的讀帶標(biāo)準(zhǔn)去處理與分析數(shù)據(jù)的模式，是一種較為合理且準(zhǔn)確的分析方法。 第二部分 第

5、一節(jié)，目的：探討用AFLP分子標(biāo)記研究湖北釘螺遺傳變異的合理樣本量與分子位點(diǎn)數(shù)。方法：選取來(lái)自于湖南君山的釘螺為研究材料，用AFLP方法對(duì)釘螺基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后分析釘螺樣本量和分子位點(diǎn)數(shù)與遺傳變異信息可靠性的關(guān)系。結(jié)果：釘螺樣本量和分子位點(diǎn)數(shù)與遺傳多樣性信息的可靠性之間存在明顯的關(guān)系。當(dāng)樣本量低于7只時(shí)，AFLP總位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)頻率、Nei's基因多樣性指數(shù)和Shannon's信息指數(shù)變化很大，而當(dāng)樣本量超過30只

6、時(shí)，這些指標(biāo)值的變化趨于平穩(wěn)。當(dāng)AFLP分子位點(diǎn)數(shù)低于128時(shí)，多態(tài)位點(diǎn)頻率、Nei's基因多樣性指數(shù)、Shannon's信息指數(shù)以及這兩個(gè)指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差變化相當(dāng)劇烈，當(dāng)分子位點(diǎn)數(shù)超過338時(shí)，這些指標(biāo)值的變化趨于穩(wěn)定。結(jié)論在用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)研究湖北釘螺的遺傳變異時(shí)，每個(gè)釘螺種群內(nèi)的樣本量最好不應(yīng)低于30只，用于研究分析的分子位點(diǎn)數(shù)最好不低于338個(gè)。 第二節(jié)，目的：探討湖北釘螺形態(tài)形狀變異信息的可靠性與樣本量的關(guān)系。方法：

7、從云南大理和湖南君山兩地區(qū)隨機(jī)抽取成年釘螺各60只，分別對(duì)釘螺殼形態(tài)數(shù)量性狀進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算各數(shù)量性狀指標(biāo)的變異系數(shù)、組間變異百分比和多樣性指數(shù)。結(jié)果：當(dāng)樣本量低于30，所得到的遺傳變異的結(jié)果極不可靠，隨著樣本量的增加遺傳變異信息的可靠性也增加，當(dāng)樣本量超過55時(shí)，所得到的遺傳變異的結(jié)果趨于穩(wěn)定。結(jié)論：在湖北釘螺形態(tài)形狀的遺傳變異研究中，每個(gè)釘螺種群以分析不少于55個(gè)釘螺標(biāo)本為好。 第三部分 第一節(jié)，目的：探討湖北釘螺種群

8、內(nèi)的遺傳變異及其程度。方法：采用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)9省(云南、四川、廣西、福建、湖南、湖北、江西、安徽、江蘇)13個(gè)釘螺種群基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分析釘螺種群內(nèi)的遺傳變異。結(jié)果13個(gè)釘螺種群AFLP擴(kuò)增片段數(shù)在403～472之間，江西星子釘螺種群內(nèi)遺傳多樣性較高，多態(tài)位點(diǎn)頻率、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)分別為93．22％、0．345和0．510，而廣西宜州釘螺種群內(nèi)遺傳多樣性較低，以上

9、3指標(biāo)分別為55．80％、0．191和0．287；廣西宜州釘螺種群內(nèi)的相似性較大，相似系數(shù)(中位數(shù))為0．904，而江蘇丹徒釘螺種群內(nèi)的相似性較低，相似系數(shù)(中位數(shù))為0．748；13個(gè)釘螺種群內(nèi)的遺傳變異差異顯著(P<0．OD，5個(gè)光殼釘螺種群內(nèi)的相似系數(shù)普遍高于8個(gè)肋殼釘螺種群內(nèi)的相似系數(shù)。結(jié)論我國(guó)大陸廣泛分布的釘螺，種群內(nèi)存在一定程度的遺傳變異。不同地區(qū)釘螺種群內(nèi)遺傳變異程度不同，有的相差較大。 第二節(jié)，目的：探討湖北釘螺

10、種群內(nèi)的形態(tài)形狀變異及其程度。方法：在中國(guó)大陸血吸蟲病流行的7個(gè)省中，采集不同環(huán)境類型的21個(gè)釘螺種群，每個(gè)種群各測(cè)量60只湖北釘螺的11個(gè)形態(tài)性狀。采用形態(tài)性狀的變異系數(shù)、種群內(nèi)個(gè)體間的歐氏距離與多樣性指數(shù)、及主成分分析3種方法，分析不同湖北釘螺種群內(nèi)形態(tài)性狀的變異程度。結(jié)果在種群內(nèi)個(gè)體間的歐氏距離和形態(tài)性狀多樣性方面，都以江西都昌的變異最大，平均歐氏距離為2．88，方差為2．33，極差為9．05，多樣性指數(shù)為1．56，個(gè)體間平均距離

11、以四川西昌湖北釘螺種群的最小，僅為1．37，而多樣性指數(shù)以四川丹棱湖北釘螺種群的最小，為0．91。在不同光殼釘螺種群中，以云南大理釘螺個(gè)體間的平均距離最大，為1．90，但方差和極差以江蘇宜興的最大，分別為0．55和4．46。結(jié)論不同湖北釘螺種群內(nèi)形態(tài)性狀變異程度存在較大的差異，肋殼釘螺種群內(nèi)的形態(tài)性狀變異程度普遍高于光殼釘螺種群內(nèi)的變異程度。 第四部分 第一節(jié)，目的：探討湖北釘螺種群間的遺傳變異及其程度。方法：采用AFL

12、P分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來(lái)自中國(guó)大陸10省的25個(gè)種群釘螺基因組DNA樣品池進(jìn)行擴(kuò)增，分析釘螺各種群間的遺傳變異并對(duì)釘螺種群進(jìn)行聚類分析。結(jié)果：25個(gè)釘螺種群間的相似系數(shù)GSDICE在0．694～0．831之間，Nei無(wú)偏遺傳一致性在0．635～O．799之間，遺傳距離D在0．169～0．306之間，Nei無(wú)偏遺傳距離在0．225～0．452之間，指名亞種(包括或不包括廣西釘螺)釘螺種群間的遺傳變異程度明顯高于滇川亞種釘螺種群間的遺傳變異程度(

13、P＜0．01)，光殼釘螺種群間的遺傳變異程度明顯高于肋殼釘螺種群間的遺傳變異程度(P＜O．01)。25個(gè)釘螺種群被聚成3類，A類包括來(lái)自福建福清和廣西宜州的光殼釘螺種群；B類包括來(lái)自四川西昌、普格、丹棱、蒲江、廣漢和云南大理的光殼釘螺種群；C類則由其它來(lái)自長(zhǎng)江中下游地區(qū)的17個(gè)釘螺種群組成。結(jié)論：在我國(guó)分布的湖北釘螺已發(fā)生較大的遺傳變異，基因組水平上的釘螺種群聚類結(jié)果和其地理分布基本一致。 第二節(jié)，目的：探討湖北釘螺種群間的形態(tài)

14、形狀變異及其程度。方法：采用數(shù)量分類法對(duì)27個(gè)釘螺種群的11個(gè)螺殼形態(tài)形狀指標(biāo)進(jìn)行了聚類和主成分分析。結(jié)果：27個(gè)釘螺種群中，以湖南華容釘螺種群與四川丹棱釘螺種群間的形態(tài)形狀變異最大，其歐氏距離達(dá)10．29，而安徽貴池與樅陽(yáng)釘螺種群間的形態(tài)形狀變異最小，其歐氏距離僅為0．62。無(wú)論指名亞種包括還是不包括廣西釘螺，滇川亞種釘螺種群間歐氏距離均明顯低于指名亞種種群間的(P＜0．05)；11個(gè)光殼釘螺種群間的歐氏距離明顯低于16個(gè)肋殼釘螺種群

15、間的歐氏距離(P＜O．05)。主成分分析將27個(gè)釘螺種群分為三組，第一組包括江陵、貴池、樅陽(yáng)、丹徒、銅陵1、江寧的釘螺。第二組包括南昌、華容、都昌、漢川、陽(yáng)新、蔡甸、南縣、星子、君山、江山的釘螺。第三組包括宜興、西昌、廣漢、蒲江、丹棱、大理、福清、石門、銅陵2、宜州、普格的釘螺。結(jié)論指名亞種釘螺種群間的形態(tài)形狀變異大于滇川亞種的，肋殼釘螺種群間的形態(tài)形狀變異大于光殼釘螺的。主成分分析的分類結(jié)果與環(huán)境類型基本一致。 第五部分

16、 第一節(jié)，目的：探討湖北釘螺的空間遺傳結(jié)構(gòu)。方法：分析25個(gè)釘螺種群間的遺傳距離與地理距離的相關(guān)性。結(jié)果：25個(gè)釘螺種群間的遺傳距離D和Nei無(wú)偏遺傳距離，都與其地理距離存在明顯的正相關(guān)性(P＜O．001)，相關(guān)系數(shù)分別為0．5234和O．5622；湖北釘螺指名亞種種群間的遺傳距離與地理距離也存在正相關(guān)(P＜0．001)，遺傳距離D的相關(guān)系數(shù)為0．5276，Nei無(wú)偏遺傳距離的為0．5770；無(wú)論是肋殼釘螺還是光殼釘螺，釘螺種群間的遺

17、傳距離都與地理距離存在正相關(guān)((P