日本血吸蟲低感染度宿主血清核酸檢測及來源和代謝規(guī)律的研究.pdf

1、目前，血吸蟲病仍是一種嚴重危害人類健康的主要寄生蟲病，影響范圍涉及亞非拉數十個國家和地區(qū)。近年來，隨著我國長期大范圍地實施以化療為主的血吸蟲病防治策略，主要血吸蟲病流行區(qū)的感染率與感染度已顯著降低，但感染者仍近百萬，流行區(qū)域并沒有明顯縮小。在當前血吸蟲病感染率和感染度均呈低度化的新形勢下，現有的診斷方法均不夠理想，特別是對于反復感染和治療后的病例，蟲卵糞檢法和循環(huán)抗原檢測法的敏感度太低；而抗體檢測又缺乏特異性，不能區(qū)分現癥病人和既往感染

2、者。隨著分子生物學技術的發(fā)展，血吸蟲病的核酸檢測已成為當前血吸蟲病診斷研究的熱點之一。本課題組前期工作表明普通PCR法和LAMP法在日本血吸蟲中、高感染度家兔模型的實驗研究中具有早期診斷價值和療效考核價值。本研究在普通PCR法的基礎上，建立了一種新的巢式PCR法，進一步探索核酸檢測法對日本血吸蟲低感染度家兔血清DNA的檢測敏感性，并對感染宿主血清中日本血吸蟲核酸的來源及代謝規(guī)律作了深入探討，初步評價了核酸檢測用于日本血吸蟲病病人血清的檢

3、測效果。全文共分三個部分：
　　 一、巢式PCR法的建立及對日本血吸蟲低感染度宿主血清DNA的檢測
　　 在普通PCR法的基礎上建立了一種敏感性和特異性更高的巢式PCR法，采用巢式PCR的外引物擴增產物構建的重組質粒作敏感性檢測，巢式PCR法檢測的敏感性為10.2個拷貝，比普通PCR法高10倍。且巢式PCR擴增產物的電泳條帶為單一、明亮的特異性條帶，較普通PCR法可更準確的判斷檢測結果。本實驗建立了更符合現場病人實際狀況

4、的日本血吸蟲低感染度家兔模型（EPG<50；蟲數<5對），采用巢式PCR法從感染后3d～19w的外周血清中均能擴增到日本血吸蟲特異性DNA片段，尤其是感染30條血吸蟲尾蚴的家兔，體內僅存活3對成蟲（EPG=14）的外周血清也可檢測出特異性DNA片段。實驗證明，巢式PCR法可用于日本血吸蟲低感染度宿主血清DNA的檢測，具有潛在應用前景。
　　 二、巢式PCR法檢測日本血吸蟲感染家兔血清DNA用于療效考核的評價
　　 應用巢

5、式PCR法對日本血吸蟲中感染度（EPG=232）家兔經吡喹酮治療后的宿主血清DNA的檢測結果表明，治療后第17w（感染后24w）宿主血清中的血吸蟲DNA轉為陰性，比前期普通PCR法檢測的結果晚6w，提示其具有更高的敏感性；而抗體檢測于感染后30w仍維持較高的滴度，表明核酸檢測法具有潛在的療效考核價值。
　　 三、巢式PCR法對100例日本血吸蟲病慢性期病人血清DNA的檢測
　　 100例糞檢陽性的慢性期病人血清，采用巢式

6、PCR法檢測的陽性檢出率為78％，其中高感染度的陽性檢出率為100％（4/4），中感染度的陽性檢出率為90％（9/10），低感染度的陽性檢出率為75.6％（65/86），陽性檢出率與感染度相關。
　　 四、日本血吸蟲感染宿主血清核酸來源及代謝規(guī)律的研究
　　 本實驗建立了單、雙性尾蚴感染的家兔模型。采用巢式PCR法從單性尾蚴感染家兔感染后3d～3w的血清中均可擴增到日本血吸蟲特異性DNA片段，感染后4w轉為陰性。由此推斷

7、日本血吸蟲感染后3d～3w，血清中的日本血吸蟲核酸主要來源于移行過程中死亡的童蟲殘體或蟲體發(fā)育過程中更新脫落的含有細胞核的表皮組織。而雙性尾蚴感染的家兔感染后3d～7w均可擴增到陽性條帶，根據日本血吸蟲的生活史，血吸蟲雌蟲感染宿主4w后發(fā)育成熟并開始大量產卵，因此，本實驗結果表明，宿主感染血吸蟲4w后血清中的血吸蟲核酸主要來源于死亡崩解的蟲卵。為進一步研究血吸蟲核酸在宿主外周血中的代謝規(guī)律，實驗組對上述單性尾蚴感染的家兔連續(xù)3w檢測為陰

8、性結果后（即感染后第7w）給與吡喹酮治療，同時對雙性感染家兔也進行治療。采用巢式PCR法繼續(xù)檢測的結果表明，單性感染的家兔給藥后2d即可在宿主血清中檢測到日本血吸蟲特異性DNA片段，該陽性結果持續(xù)3w后復轉陰；而雙性感染家兔給藥后16w均可檢測到陽性條帶。上述結果顯示了宿主血清中血吸蟲核酸代謝的動態(tài)變化，即源自死亡成蟲殘體的核酸代謝物于治療后第2d即可出現在宿主外周血清中，分解代謝3w后逐漸消失；而源自血吸蟲蟲卵的核酸代謝產物，由于蟲卵