雙靶標Real-time PCR檢測血清DNA用于日本血吸蟲感染宿主短期療效考核及哨鼠預(yù)警的研究.pdf

1、第一部分雙靶標Real-time PCR法對日本血吸蟲病家兔模型不同病期血清DNA的短期療效考核
　　目的：應(yīng)用雙靶標Real-time PCR法檢測感染宿主不同病期吡喹酮治療后血清DNA的動態(tài)變化，探索和評價以蟲體DNA轉(zhuǎn)陰作為療效考核的時間節(jié)點，用于短期療效考核的潛在價值。
　　方法：建立日本血吸蟲病家兔模型，除對照組家兔外，分別在感染后4w、7w、12w和16w按200㎎/㎏體重的劑量給予實驗組家兔吡喹酮治療（隔一周加

2、強治療一次）。于治療后1-7 d（每天）、第2 w至處死（每周），與對照組家兔同步收集血清。抽提血清DNA，以雙靶標Real-time PCR法進行檢測。
　　結(jié)果：雙靶標Real-time PCR法均可在感染后3d的血清模板中檢測到陽性產(chǎn)物。雙靶標Real-time PCR法在家兔感染后3d～42w的血清中均可檢測出陽性DNA；對不同病期治療后血清DNA檢測結(jié)果顯示，SjR2-QPCR和Sj19-QPCR檢測的血清 DNA峰值均

3、出現(xiàn)在治療后3d-4d，兩種靶標在感染后4w、7w、12w、16w治療組血清DNA的轉(zhuǎn)陰時間分別為治療后的6w-7w、15w-16w、18w-20w和26w-28w。在雙性感染治療后宿主血清蟲體DNA轉(zhuǎn)陰拐點的研究中，ROC分析提示，感染家兔均在治療后2w左右蟲體DNA呈轉(zhuǎn)陰趨勢。
　　結(jié)論：Real-time PCR法對于日本血吸蟲病具有早期診斷價值。兩種靶標的QPCR定量檢測結(jié)果顯示，兩種靶標均具有較高的敏感性且兩者存在一定的

4、互補性。前期研究顯示，在感染宿主中血吸蟲血清 DNA來源于蟲體和蟲卵，通過定量檢測血清DNA結(jié)果顯示，兩種靶標對不同病期治療后血清DNA的轉(zhuǎn)陰時間從6w-7w至26w-28w不等，而如依據(jù)血清中血吸蟲蟲體DNA的變化規(guī)律，經(jīng)ROC分析推測蟲體 DNA轉(zhuǎn)陰時間節(jié)點，可大大縮短療效考核時間。本研究結(jié)果為探索以治療后血清蟲體 DNA轉(zhuǎn)陰時間節(jié)點作為短期療效考核的潛在應(yīng)用價值，提供了實驗依據(jù)。
　　第二部分雙靶標巢式PCR法在日本血吸蟲哨

5、鼠預(yù)警模型中的應(yīng)用研究
　　目的：將雙靶標巢式PCR法用于日本血吸蟲哨鼠預(yù)警，探索該方法的靈敏性，評價其對早期預(yù)警的價值。
　　方法：建立分別感染5條、10條和20條雙性日本血吸蟲尾蚴的哨鼠模型，將小鼠隨機平均分為兩組，一組用于剖解以評價實際感染程度，另一組分別在感染前（0d）和感染后3d、5d、1w和2w收集3組不同感染度小鼠血清，用兩種靶標巢式PCR檢測血清DNA，同時設(shè)兩種免疫學(xué)方法對照。
　　結(jié)果: Sj19巢

6、式 PCR法對3組不同感染度小鼠在感染后4個時間點的血清DNA均可檢出陽性結(jié)果；SjR2巢式PCR可檢出感染5條雙性尾蚴小鼠的感染后5d的血清 DNA，對感染10條雙性尾蚴小鼠的感染后3d、5d、1w的血清 DNA可檢出，對感染20條雙性尾蚴小鼠的感染后4個時間點的血清DNA均可檢出。而兩種免疫學(xué)方法（IHA和ELISA）對3組不同感染度小鼠的感染后4個時間點的血清均未檢出陽性結(jié)果。
　　結(jié)論：Sj19和SjR2巢式PCR法對哨鼠

7、模型可在感染后3d或5d檢測出特異性DNA，顯示出較高的靈敏性。特別是Sj19巢式PCR法在感染5條雙性日本血吸蟲尾蚴小鼠的感染后3d血清DNA中即可檢出陽性 DNA，顯示出更高的靈敏性。本研結(jié)果表明，應(yīng)用Sj19和SjR2巢式PCR法檢測哨鼠模型血清DNA，大大縮短了預(yù)警時間，對日本血吸蟲哨鼠早期預(yù)警具有潛在的實際應(yīng)用價值。
　　第三部分日本血吸蟲尾蚴性別鑒定及配對感染后雌雄合抱率的研究
　　目的：評價PCR法鑒定日本血吸

8、蟲尾蚴性別的效果，并探索不同感染度的雌雄尾蚴配對感染時，雌雄尾蚴易感性的差別，以及蟲體存活和合抱率的變化。
　　方法：收集不同單只陽性釘螺逸出的尾蚴，每只釘螺取兩個尾蚴樣本，堿裂解抽提尾蚴DNA，應(yīng)用序列特征化擴增聚合酶鏈式反應(yīng)(SCAR-PCR)法鑒定單只釘螺逸出尾蚴的性別，將鑒定后的釘螺按雌、雄性別分開飼養(yǎng)，約20天后再次逸出尾蚴，分別收集雌、雄尾蚴以5♂+5♀、10♂+10♀和15♂+15♀三個不同感染度配對感染小鼠，40d

9、后解剖，記錄每只小鼠檢獲蟲體情況。
　　結(jié)果：共23只陽性釘螺，經(jīng)鑒定，10只釘螺可逸出單雌性尾蚴，9只釘螺可逸出單雄性尾蚴，4只釘螺可逸出雙性尾蚴。
　　在配對感染中，感染5♂+5♀、10♂+10♀和15♂+15♀三組小鼠的雌、雄蟲存活率分別為72.0％和82.0%、71.3%和85.0%、62.0%和72.7%，經(jīng)統(tǒng)計分析雌、雄尾蚴易感性無顯著性差異；三組小鼠蟲體總存活率分別為77.0%、78.0%、67.7%，其中感染