白頭翁總皂苷對日本血吸蟲及其宿主的作用和機制研究.pdf

1、目的：
　　通過研究白頭翁總皂苷（Pulsatilla chinensis(Bunge) Regel saponins，PRS）對日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）中間宿主釘螺（Oncomelania hupensis）的殺滅作用、對釘螺新陳代謝關鍵酶的影響、對斑馬魚和哺乳動物的毒性、對日本血吸蟲體內外不同發(fā)育階段的作用及對感染日本血吸蟲小鼠的免疫調節(jié)作用，為白頭翁總皂苷成為新的抗血吸蟲新藥提供理論和實驗依據(jù)

2、。
　　方法：
　　1.采用浸泡法，進行浸殺釘螺試驗、釘螺上爬試驗及斑馬魚毒性試驗；采用酶促動力學方法檢測釘螺暴露在PRS濃度為浸泡24h LC50的40%和80%藥液中24h后的頭足及肝臟膽堿酯酶（choline esterase，CHE）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、乳酸脫氫酶（lactate dehydro

3、genase，LDH）的酶活值；采用透射電鏡觀察濃度為24h LC50的PRS作用釘螺后其頭足及肝臟的超微結構；采用中華人民共和國國家標準GB15670-1995進行哺乳動物急性經(jīng)口毒性試驗和皮膚、眼睛刺激試驗。
　　2.采用尾蚴腹部貼片法感染ICR小鼠，感染后42d的小鼠肝臟經(jīng)過研磨、過篩獲得蟲卵，毛蚴由蟲卵孵化，尾蚴由陽性感染釘螺光照逸出，用含有0、1、2、3、4、5、6、7、8μg/ml的PRS藥液分別在不同的時間作用于蟲卵

4、、毛蚴、尾蚴；PRS對體外培養(yǎng)的日本血吸蟲不同發(fā)育階段的作用采用經(jīng)皮膚或灌注沖蟲法在3h、7、14、42d對感染不同數(shù)量尾蚴的小鼠進行剖殺取蟲，用含有0、1、5、10、20、30μg/ml的PRS培養(yǎng)液對童蟲及成蟲進行培養(yǎng)，觀察藥物在不同時間段的殺蟲作用；將感染50條日本血吸蟲尾蚴的小鼠在血吸蟲不同發(fā)育階段用不同劑量的PRS藥液灌服，42d后灌注沖蟲計算荷蟲量及減蟲率；將感染80條尾蚴的小鼠在感染后的不同時間經(jīng)過尾靜脈注射25mg/kg

5、 PRS藥液，42d后灌注沖蟲計算荷蟲量及減蟲率；PRS對日本血吸蟲糖原、蛋白及酶的影響采用對感染42d的小鼠一次性尾靜脈注射25mg/kg的PRS藥液，24h后剖殺取蟲研磨，檢測PRS對蟲新陳代謝的影響。
　　3.采用感染50條尾蚴的C57BL/6小鼠連續(xù)49d口服150mg/kg/d劑量的PRS，通過檢測小鼠體重、肝脾重量的變化及減蟲效果估計長期用藥的治療效果；通過檢測感染治療組與感染不治療組之間小鼠白細胞及其組成細胞的比率變

6、化、肝臟的免疫組化、血清IFN-γ、IL-4、TGF-β和IL-17水平的變化、蟲卵可溶性抗原（soluble egg antigen，SEA）特異性抗體IgG、IgG1、IgG2a值的改變探究PRS對日本血吸蟲感染小鼠的免疫調節(jié)作用。
　　結果：
　　1. PRS經(jīng)過24h、48h、72h浸殺釘螺后的LC50分別為0.48、0.23、0.17mg/l， LC90分別為2.64、0.81、0.34mg/l；8和4mg/l P

7、RS作用后無釘螺上爬，0.5mg/l PRS作用24h后總上爬率為26.67%，0.5mg/lNIC作用24h后總上爬率為47.78%。釘螺用PRS濃度為40%及80%的24h LC50浸泡24h后，其頭足及肝臟的CHE、AKP、ALT的活力明顯降低（P＜0.05），LDH變化不大；24h LC50 PRS作用24h后，釘螺頭足及肝臟細胞的透射電鏡顯示PRS對釘螺的超微結構有一定程度的損傷；斑馬魚試驗顯示相對于氯硝硫胺（niclosam

8、ide，NIC），PRS對魚類的致死濃度與殺螺濃度差別較大；哺乳動物急性經(jīng)口毒性試驗、眼刺激實驗、急性皮膚刺激試驗結果顯示PRS對哺乳動物無毒性。
　　2.不同濃度的PRS及對照藥物吡喹酮（praziquantel，PZQ）對日本血吸蟲蟲卵作用24h后的孵化結果顯示PRS對蟲卵孵化的抑制效果略優(yōu)于PZQ的作用，尤其是在4μg/ml濃度時，日本血吸蟲蟲卵對 PRS的作用更敏感；PRS及對照藥物PZQ在不同時間對毛蚴、尾蚴的作用結果顯

9、示其死亡率對PRS及PZQ的濃度及作用時間有一定的依賴性；在不同濃度PRS作用下日本血吸蟲各個發(fā)育時期體外培養(yǎng)的結果顯示藥物對日本血吸蟲的3h、7、14d童蟲及42d成蟲均有殺傷作用；日本血吸蟲雄蟲及雌蟲經(jīng)過30μg/ml PRS體外作用4h后蟲體體表的感覺乳突及皮層均有一定程度的損壞；不同劑量PRS對不同感染時期的小鼠口服用藥結果表明高、中、低劑量的PRS在體內均有一定的殺蟲作用，但300mg/kg劑量的PRS有較好的療效，感染1d和

10、21d開始用藥的殺蟲及殺雌蟲效果均優(yōu)于相同劑量的青蒿琥酯（artesunate，ART）和PZQ；尾靜脈注射25mg/kg劑量PRS的實驗結果表明在日本血吸蟲感染小鼠的不同階段用藥均有比較好的殺蟲作用；25mg/kg劑量 PRS作用24h后日本血吸蟲雄蟲、雌蟲的糖原、蛋白、AKP、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽還原酶（glutathio

11、ne reductase，GR）均有所降低。
　　3.用150mg/kg/d劑量的PRS連續(xù)49d灌服感染50條尾蚴的C57BL/6小鼠發(fā)現(xiàn)，PRS治療組小鼠體重的增加與感染不治療組比較存在明顯差異（P＜0.01），肝脾重量的降低與感染不治療組比較存在明顯差異（P＜0.01）；PRS治療后小鼠白細胞的降低與感染不治療組比較存在明顯差異（P＜0.01），中性粒細胞、單核細胞及嗜酸性細胞比率的降低與感染不治療組比較存在明顯差異（P＜0

12、.01），淋巴細胞和嗜堿性細胞比率的增多與感染不治療組比較存在明顯差異（P＜0.01）；PRS長期用藥對感染50條尾蚴小鼠的荷蟲量結果顯示PRS用藥組與感染不治療組比較減蟲效果存在明顯差異（P＜0.01），減蟲率為55.27%。肝臟蟲卵的減少與不治療組比較存在明顯差異（P＜0.01）；用藥49d后小鼠肝臟的蘇木素伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）顯示PRS用藥組肝臟的蟲卵及卵周圍炎性細胞相

13、對于感染不治療組較少；免疫組化顯示 PRS藥物治療后肝臟的α-平滑肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、金屬蛋白酶抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase1，TIMP-1）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor beta1， TGF-β1）、Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ）及Ⅳ型膠原（collagen typ

14、eⅣ）的表達與感染不治療組比較明顯減弱；PRS治療組與感染不治療組比較小鼠血清中的IFN-γ、IL-4、TGF-β和 IL-17水平均有明顯差異（P＜0.01）；PRS治療組SEA特異性抗體IgG、IgG1水平與感染不治療組相比明顯降低（P＜0.01）；PRS治療組與感染不治療組相比SEA特異性抗體IgG2a水平變化不大（P＞0.05），PRS治療組與感染不治療組相比較IgG1/IgG2a比率降低。
　　結論：
　　1.實驗