中藥白頭翁提取的新活性分子白頭翁皂苷甲(BD)抗腫瘤作用的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌在中國的發(fā)病率一直居高不下，胰腺癌的發(fā)病率近些年也呈現(xiàn)迅猛的上升趨勢。而且肝癌和胰腺癌惡性程度高，生存期短。雖然近年來手術(shù)治療進(jìn)展很大，但由于明確診斷時大多為中晚期，缺乏有效的治療方法。所以綜合治療成為主要的治療手段，包括介入治療、放射治療、中醫(yī)藥、熱療等。中醫(yī)中藥治療由于癥狀改善顯著，副反應(yīng)小，全身狀態(tài)保持較好，腫瘤亦可縮小或帶瘤長期生存等優(yōu)點使中醫(yī)中藥在綜合治療中占有重要地位。
　　 近年來，植物來源的藥物得到越來

2、越多的重視。通過從傳統(tǒng)中草藥中尋找新的獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而創(chuàng)制新的先導(dǎo)化合物的途徑，大大提高了新藥的發(fā)現(xiàn)率。
　　 白頭翁皂苷甲(BD)是我們從中草藥白頭翁提取的一種新的活性分子。本論文將就該活性分子抗腫瘤效應(yīng)及其作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 藥物的來源與制備：
　　 蘇州大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)實驗室首先從白頭翁中分離獲得純白頭翁皂苷甲粉劑，命名為“BD”。制備步驟如下：
　　 干燥白頭翁藥材(20公斤)，回流下

3、用70％的乙醇(3×60L，各3小時)提取三次后，減壓下干燥，得到的殘余物(2.40千克)，將其溶解在蒸餾水中，然后通過D101樹脂(10×150厘米)，乙醇：水梯度25毫升/分鐘洗脫25毫升/分鐘，0:100(25L)，30:70(50升)，60:40(100升)，90:10(50升)。乙醇：水梯度60:40組分在真空下干燥。取干燥后的混合物(450克)，通過動態(tài)軸向壓縮色譜(DACC)。MeOH：H2O77:23(10升)，81:1

4、9(10升)，85:15(10L)和90:10(10升)，用300毫升/分鐘的流速，梯度洗脫。純白頭翁皂苷甲為85:15洗脫的餾分。HPLC分析PDA檢測白頭翁皂苷甲的純度為95.2%。命名為“BD”(結(jié)構(gòu)圖如下)。
　　 第一部分：白頭翁皂苷甲(BD)在體外抑瘤作用的實驗研究
　　 目的：探討B(tài)D分子體外對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。方法：提純后的BD粉劑溶于100%酒精中，加入對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞株7721、胰腺癌細(xì)胞株S

5、W1990及BXPC3細(xì)胞，通過cck-8觀測細(xì)胞的生長狀況，流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)行細(xì)胞周期分析，細(xì)胞染色觀察細(xì)胞形態(tài)，Annexin-V染色后流式細(xì)胞儀檢測凋亡。結(jié)果：生長曲線顯示與對照組相比，BD能明顯抑制肝癌細(xì)胞株及胰腺癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖(P<0.05)；細(xì)胞周期分析示BD能使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2期(P<0.05)；Annexin-V染色后流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示BD處理后凋亡明顯增加，并且隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比例亦增加。結(jié)論：B

6、D分子體外具有抑瘤效應(yīng)。其抑瘤效應(yīng)主要通過使腫瘤細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
　　 第二部分：白頭翁皂苷甲(BD)在體內(nèi)抑瘤作用的實驗研究
　　 前期實驗，我們已經(jīng)證實，BD在體外能抑制腫瘤細(xì)胞(肝癌、胰腺癌)的增殖。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其影響增殖主要是使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2期，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。但是中藥的作用機(jī)制是復(fù)雜的，藥物進(jìn)入體內(nèi)后，將受到體內(nèi)各種因素的影響。
　　 目的：探討B(tài)D分

7、子裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用。方法：裸鼠移植瘤成瘤至一定體積后，通過腹腔注射或灌胃BD，觀察移植瘤生長曲線、抑瘤率、體重、臟器指數(shù)等指標(biāo)。CTX為陽性對照。結(jié)果：與對照組比較，BD組裸鼠體重變化不明顯(P>0.05)；與對照組比，CTX組、BD組瘤重顯著降低(P<0.05)，不管是腹腔注射還是灌胃組；與對照組比，僅見CTX組脾系數(shù)顯著降低(P<0.05)，BD變化不明顯(P>0.05)；與CTX組相似，BD組在給藥12天后，裸鼠移植瘤生長明顯

8、慢于對照組，實驗結(jié)束時，BD組瘤體積顯著小于對照組(P<0.05)；病理切片示，與CTX組相似，BD組移植瘤現(xiàn)大面積壞死、變性，同時纖維組織大量增生，與對照組明顯不同。結(jié)論：在裸鼠體內(nèi)，與CTX相似，BD能很好抑制移植瘤的生長，即BD亦具有很好的抗瘤作用。
　　 第三部分：白頭翁皂苷甲(BD)抑瘤作用機(jī)制的研究
　　 前面幾部分的實驗已證實，BD在體外能通過細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)凋亡，從而抑制肝癌和胰腺癌細(xì)胞株的生長。體內(nèi)實

9、驗亦證實，不管是通過腹腔注射還是直接灌胃，BD均能抑制裸鼠移植瘤的生長。
　　 目的：探討B(tài)D分子抗腫瘤作用的分子機(jī)制。方法：通過分子生物學(xué)方法，明確BD分子作用通路，單分子凝膠電泳探究BD作用的機(jī)制。結(jié)果：BD處理后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)BCL2表達(dá)明顯減低，并且具有劑量效應(yīng)。Cyclin B的表達(dá)明顯增加，并且具有劑量效應(yīng)。同時藥物處理組p53表達(dá)成劑量效應(yīng)的增加。單細(xì)胞凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)藥物處理組，腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂情況明顯嚴(yán)重。