中間宿主釘螺和釘螺間日本血吸蟲的遺傳關系.pdf

1、目的：血吸蟲病是一種流行廣泛、嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，而我國屬于血吸蟲病流行最嚴重國家之一。我國血吸蟲病的流行現主要局限于水位難以控制的湖沼地區(qū)和山區(qū)。血吸蟲因生態(tài)環(huán)境（如終宿主）不同或選擇壓力（如化療）而形成相應的血吸蟲亞群或株，而其傳播流行可通過群體遺傳學方法進行分析。群體遺傳學方法在血吸蟲上已有廣泛研究，然而多側重于地區(qū)間或終宿主間的群體遺傳結構分析，而有關中間宿主體內和中間宿主間血吸蟲個體間的遺傳關系較少。因此，本研

2、究以前期研究的山區(qū)型血吸蟲病流行區(qū)為現場，通過現場調查感染性釘螺，室內逸出尾蚴感染小鼠收集蟲體，利用微衛(wèi)星位點對蟲體進行基因分型，進而分析血吸蟲群體遺傳多樣性及釘螺內和釘螺間血吸蟲的親緣關系，有助于深入了解血吸蟲的傳播特征，為建立血吸蟲病傳播動力學數學模型提供參數，同時為有效地控制血吸蟲病流行提供新思路。
　　方法：從已發(fā)表文章中選擇17對多態(tài)性較好、適用于本研究的微衛(wèi)星引物，對這些引物進行同一體系和PCR反應條件擴增，對擴增不好

3、的引物進行溫度梯度PCR擴增，對擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測，確定各自最佳退火溫度。舍棄擴增不好的引物，運用余下引物對3只釘螺的41份血吸蟲樣本進行PCR擴增、瓊脂糖電泳檢測、檢測片段大小，將結果整理成基因型數據?；谘x個體基因型，檢測每對引物是否能將來自不同釘螺的血吸蟲個體鑒別開。舍棄鑒別失敗的引物，最終確定用于研究血吸蟲遺傳關系的微衛(wèi)星引物。
　　將從血吸蟲病流行現場（安徽石臺地區(qū)）采集到的釘螺帶回實驗室進行逸蚴實驗，鑒別陽

4、性釘螺。將陽性釘螺逸出的尾蚴感染小鼠，收集血吸蟲成蟲。運用最終確定的微衛(wèi)星位點對血吸蟲成蟲進行基因分型。
　　對血吸蟲基因型數據進行統(tǒng)計分析前，利用GENECAP1.2.2剔除釘螺內相同基因型的血吸蟲。接著利用FSTAT2.9.3進行群體遺傳多樣性分析，包括各位點等位基因數目、等位基因頻率、有效等位基因數目、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和近交系數(Fis)及其標準差，各位點的多態(tài)信息含量(PIC)釆用相關公式計算；對各位

5、點利用GENEPOP4.0進行哈迪-溫伯格平衡檢驗；對釘螺間血吸蟲基因型分布進行Poisson分布擬合優(yōu)度檢驗（x2檢驗）。利用SPAGeDi1.3軟件計算釘螺內和釘螺間日本血吸蟲親緣關系系數；利用Colony2.0進行胞系分析，推斷釘螺內和釘螺間日本血吸蟲的胞系關系。
　　結果：
　　1.現場采集8563只釘螺，篩選得到67只陽性釘螺。陽性釘螺經逸蚴實驗，最終成功感染46只小鼠，收集到472條血吸蟲成蟲。
　　經過引

6、物篩選和條件優(yōu)化，最終確定12對微衛(wèi)星引物。12個微衛(wèi)星位點的等位基因數從4到25個不等，平均每個位點上含有16.7個等位基因。有效等位基因數的范圍為1.103-1.922。12個微衛(wèi)星位點的觀測雜合度范圍為0.005-0.914，平均為0.633；而期望雜合度的范圍為0.057-0.557，平均為0.437；多態(tài)信息含量的范圍為0.1-0.914，平均為0.743，除sjp4和sjp22之外，其余10個位點多態(tài)信息含量均大于0.5。本

7、研究初步認為篩選出的12對微衛(wèi)星標記適用于日本血吸蟲，可以作為其遺傳學研究的良好標記。
　　2.12個微衛(wèi)星位點近交系數（Fis）的范圍為-0.709-0.779，平均值為-0.365，表明：sjp22位點雜合子缺失（Fis>0），其余11個位點均表現為雜合子過剩(Fis<0)。Hardy-Weinberg平衡檢驗表明12個位點中只有3個位點（sjp32, sjp42, sjp63）符合此平衡（P>0.05），其余均偏離Hardy

8、-Weinberg平衡（P<0.05)。Poisson分布擬合優(yōu)度檢驗顯示，釘螺間血吸蟲基因型分布呈過度分布（P<0.005），其中21％的釘螺含有單基因型，其余含有多種基因型。
　　3.日本血吸蟲親緣關系分析結果為：12個微衛(wèi)星位點的親緣關系系數范圍為0.030-0.866，平均值為0.723；205條血吸蟲親緣關系系數為0.164(±0.159)；46只釘螺內日本血吸蟲親緣關系系數為0.670(±0.240)；46只釘螺間日本

9、血吸蟲親緣關系系數為0.150(±0.131)。表明釘螺內的血吸蟲親緣關系較近，釘螺間親緣關系較遠。
　　4.在兩種錯誤率（1%和2%）設置條件下進行Colony分析，發(fā)現家系結構基本無差別，釘螺內的家系結構為：7只釘螺，其體內血吸蟲分別來源于2個家系，其中螺A3P2和螺C3P1為混合感染(mixed-sex infection)，雌蟲和雄蟲分別來自不同家系；1只釘螺（螺C6P3），其血吸蟲來源于3個家系，其余38只釘螺均只有1個

10、家系，且為單性感染；釘螺間的家系結構為，205條血吸蟲成蟲來自于53個家系，每個家系血吸蟲數目范圍為1-15條，3個家系分別感染兩只釘螺，其余家系均感染單只釘螺。結果表明：一只釘螺內的日本血吸蟲大多為同胞關系，即它們來自于同一家系，而不同的血吸蟲家系多感染不同釘螺。
　　結論：
　　1.本研究初步確定了用于日本血吸蟲親緣關系研究的12個微衛(wèi)星位點：sjp1, sjp4, sjp18, sjp22, sjp28, sjp32,

11、 sjp34, sjp42, sjp45, sjp54, sjp60, sjp63。
　　2.多數釘螺被一個家系感染，少數被多個家系（螺A2P1，A3P2，A6P3，B4P3，C1P4，C3P1，C6P3，D4P3）感染，且螺A3P2、C3P1為混合感染。前者提示螺點終宿主活動不多，具有一定的傳播意義，后者提示終宿主種類較多或者活動較為頻繁，傳播意義較強。其中，混合感染釘螺A3P2、C3P1的傳播意義最強。
　　3.釘螺內的