中間宿主釘螺和釘螺間日本血吸蟲的遺傳關(guān)系.pdf

1、目的：血吸蟲病是一種流行廣泛、嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，而我國屬于血吸蟲病流行最嚴(yán)重國家之一。我國血吸蟲病的流行現(xiàn)主要局限于水位難以控制的湖沼地區(qū)和山區(qū)。血吸蟲因生態(tài)環(huán)境（如終宿主）不同或選擇壓力（如化療）而形成相應(yīng)的血吸蟲亞群或株，而其傳播流行可通過群體遺傳學(xué)方法進(jìn)行分析。群體遺傳學(xué)方法在血吸蟲上已有廣泛研究，然而多側(cè)重于地區(qū)間或終宿主間的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，而有關(guān)中間宿主體內(nèi)和中間宿主間血吸蟲個(gè)體間的遺傳關(guān)系較少。因此，本研

2、究以前期研究的山區(qū)型血吸蟲病流行區(qū)為現(xiàn)場(chǎng)，通過現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查感染性釘螺，室內(nèi)逸出尾蚴感染小鼠收集蟲體，利用微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)蟲體進(jìn)行基因分型，進(jìn)而分析血吸蟲群體遺傳多樣性及釘螺內(nèi)和釘螺間血吸蟲的親緣關(guān)系，有助于深入了解血吸蟲的傳播特征，為建立血吸蟲病傳播動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型提供參數(shù)，同時(shí)為有效地控制血吸蟲病流行提供新思路。
　　方法：從已發(fā)表文章中選擇17對(duì)多態(tài)性較好、適用于本研究的微衛(wèi)星引物，對(duì)這些引物進(jìn)行同一體系和PCR反應(yīng)條件擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增不好

3、的引物進(jìn)行溫度梯度PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，確定各自最佳退火溫度。舍棄擴(kuò)增不好的引物，運(yùn)用余下引物對(duì)3只釘螺的41份血吸蟲樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖電泳檢測(cè)、檢測(cè)片段大小，將結(jié)果整理成基因型數(shù)據(jù)?；谘x個(gè)體基因型，檢測(cè)每對(duì)引物是否能將來自不同釘螺的血吸蟲個(gè)體鑒別開。舍棄鑒別失敗的引物，最終確定用于研究血吸蟲遺傳關(guān)系的微衛(wèi)星引物。
　　將從血吸蟲病流行現(xiàn)場(chǎng)（安徽石臺(tái)地區(qū)）采集到的釘螺帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行逸蚴實(shí)驗(yàn)，鑒別陽

4、性釘螺。將陽性釘螺逸出的尾蚴感染小鼠，收集血吸蟲成蟲。運(yùn)用最終確定的微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)血吸蟲成蟲進(jìn)行基因分型。
　　對(duì)血吸蟲基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析前，利用GENECAP1.2.2剔除釘螺內(nèi)相同基因型的血吸蟲。接著利用FSTAT2.9.3進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，包括各位點(diǎn)等位基因數(shù)目、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)目、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和近交系數(shù)(Fis)及其標(biāo)準(zhǔn)差，各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)釆用相關(guān)公式計(jì)算；對(duì)各位

5、點(diǎn)利用GENEPOP4.0進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)；對(duì)釘螺間血吸蟲基因型分布進(jìn)行Poisson分布擬合優(yōu)度檢驗(yàn)（x2檢驗(yàn)）。利用SPAGeDi1.3軟件計(jì)算釘螺內(nèi)和釘螺間日本血吸蟲親緣關(guān)系系數(shù)；利用Colony2.0進(jìn)行胞系分析，推斷釘螺內(nèi)和釘螺間日本血吸蟲的胞系關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.現(xiàn)場(chǎng)采集8563只釘螺，篩選得到67只陽性釘螺。陽性釘螺經(jīng)逸蚴實(shí)驗(yàn)，最終成功感染46只小鼠，收集到472條血吸蟲成蟲。
　　經(jīng)過引

6、物篩選和條件優(yōu)化，最終確定12對(duì)微衛(wèi)星引物。12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)從4到25個(gè)不等，平均每個(gè)位點(diǎn)上含有16.7個(gè)等位基因。有效等位基因數(shù)的范圍為1.103-1.922。12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度范圍為0.005-0.914，平均為0.633；而期望雜合度的范圍為0.057-0.557，平均為0.437；多態(tài)信息含量的范圍為0.1-0.914，平均為0.743，除sjp4和sjp22之外，其余10個(gè)位點(diǎn)多態(tài)信息含量均大于0.5。本

7、研究初步認(rèn)為篩選出的12對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記適用于日本血吸蟲，可以作為其遺傳學(xué)研究的良好標(biāo)記。
　　2.12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)近交系數(shù)（Fis）的范圍為-0.709-0.779，平均值為-0.365，表明：sjp22位點(diǎn)雜合子缺失（Fis>0），其余11個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)為雜合子過剩(Fis<0)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)表明12個(gè)位點(diǎn)中只有3個(gè)位點(diǎn)（sjp32, sjp42, sjp63）符合此平衡（P>0.05），其余均偏離Hardy

8、-Weinberg平衡（P<0.05)。Poisson分布擬合優(yōu)度檢驗(yàn)顯示，釘螺間血吸蟲基因型分布呈過度分布（P<0.005），其中21％的釘螺含有單基因型，其余含有多種基因型。
　　3.日本血吸蟲親緣關(guān)系分析結(jié)果為：12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的親緣關(guān)系系數(shù)范圍為0.030-0.866，平均值為0.723；205條血吸蟲親緣關(guān)系系數(shù)為0.164(±0.159)；46只釘螺內(nèi)日本血吸蟲親緣關(guān)系系數(shù)為0.670(±0.240)；46只釘螺間日本

9、血吸蟲親緣關(guān)系系數(shù)為0.150(±0.131)。表明釘螺內(nèi)的血吸蟲親緣關(guān)系較近，釘螺間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　4.在兩種錯(cuò)誤率（1%和2%）設(shè)置條件下進(jìn)行Colony分析，發(fā)現(xiàn)家系結(jié)構(gòu)基本無差別，釘螺內(nèi)的家系結(jié)構(gòu)為：7只釘螺，其體內(nèi)血吸蟲分別來源于2個(gè)家系，其中螺A3P2和螺C3P1為混合感染(mixed-sex infection)，雌蟲和雄蟲分別來自不同家系；1只釘螺（螺C6P3），其血吸蟲來源于3個(gè)家系，其余38只釘螺均只有1個(gè)

10、家系，且為單性感染；釘螺間的家系結(jié)構(gòu)為，205條血吸蟲成蟲來自于53個(gè)家系，每個(gè)家系血吸蟲數(shù)目范圍為1-15條，3個(gè)家系分別感染兩只釘螺，其余家系均感染單只釘螺。結(jié)果表明：一只釘螺內(nèi)的日本血吸蟲大多為同胞關(guān)系，即它們來自于同一家系，而不同的血吸蟲家系多感染不同釘螺。
　　結(jié)論：
　　1.本研究初步確定了用于日本血吸蟲親緣關(guān)系研究的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)：sjp1, sjp4, sjp18, sjp22, sjp28, sjp32,

11、 sjp34, sjp42, sjp45, sjp54, sjp60, sjp63。
　　2.多數(shù)釘螺被一個(gè)家系感染，少數(shù)被多個(gè)家系（螺A2P1，A3P2，A6P3，B4P3，C1P4，C3P1，C6P3，D4P3）感染，且螺A3P2、C3P1為混合感染。前者提示螺點(diǎn)終宿主活動(dòng)不多，具有一定的傳播意義，后者提示終宿主種類較多或者活動(dòng)較為頻繁，傳播意義較強(qiáng)。其中，混合感染釘螺A3P2、C3P1的傳播意義最強(qiáng)。
　　3.釘螺內(nèi)的