日本血吸蟲感染不同適宜性嚙齒類動物后宿主及蟲體miRNA表達分析.pdf

1、血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的危害嚴重的人畜共患寄生蟲病，在我國流行的是日本血吸蟲病，目前仍是我國最重要的公共衛(wèi)生問題之一。日本血吸蟲可感染40多種哺乳動物宿主，不同宿主對血吸蟲感染的適宜性存在較大的差別。山羊、黃牛、綿羊、兔子和小鼠等都是其適宜宿主，血吸蟲的發(fā)育率可達50％～70％，而在大鼠、水牛等非適宜宿主體內(nèi)血吸蟲的發(fā)育率僅為10％左右，東方田鼠是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一種感染血吸蟲后不致病的哺乳動物，血吸蟲感染東方田鼠后，蟲體發(fā)育遲緩，大

2、部分蟲體在感染后15天死亡，不能發(fā)育成熟。不同的宿主有著獨特的機體內(nèi)環(huán)境，會影響日本血吸蟲的生長發(fā)育、雌雄合抱和蟲卵形成，最終影響蟲體在宿主體內(nèi)的存活狀態(tài)及宿主的病理變化。
　　miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，研究發(fā)現(xiàn)其在多個生物學過程如生長發(fā)育、凋亡、增殖、細胞分化、能量代謝、免疫調(diào)控及腫瘤發(fā)生等發(fā)揮重要的作用。本研究利用Solexa高通量測序技術(shù)，對不同適宜性嚙齒類宿主來源的童蟲進行miRNA的鑒定及分析，對與mi

3、RNA調(diào)節(jié)息息相關(guān)的血吸蟲凋亡通路及凋亡相關(guān)基因作了分析;利用miRNA芯片比較、分析小鼠、大鼠和東方田鼠三種不同適宜性宿主感染日本血吸蟲前后miRNA的表達譜變化。本研究可加深理解miRNA在血吸蟲的生長發(fā)育、與宿主相互作用等生物學過程中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用提供理論基礎(chǔ)，也可為篩選血吸蟲的早期診斷分子標記、疫苗候選分子和新治療藥物靶標提供新的思路和新途徑。
　　一、不同適宜性嚙齒類宿主來源日本血吸蟲童蟲miRNA的初步鑒定及血吸蟲凋亡

4、研究
　　用Solexa深度測序法對小鼠、大鼠和東方田鼠來源的日本血吸蟲童蟲進行測序，結(jié)果一共得到35585878條高質(zhì)量的reads，其中有效的reads共有28088302條。進一步的生物信息學分析表明，小鼠來源的童蟲中有131個miRNA，大鼠來源的童蟲中有100個，東方田鼠來源童蟲有144個，其中有32個miRNA在三種宿主來源童蟲中均有表達，并對已知的28個日本血吸蟲miRNA分子進行聚類和差異表達分析。本研究共鑒定出5

5、0個新miRNA分子，其中保守的有34條，日本血吸蟲特有的有16條。這些miRNA分子的發(fā)現(xiàn)對研究日本血吸蟲在不同宿主體內(nèi)的生長發(fā)育、凋亡、營養(yǎng)代謝及相互作用提供了有價值信息，為后續(xù)深入研究miRNA分子在血吸蟲基因表達調(diào)控中的可能作用機制提供了理論依據(jù)。
　　本課題組前期研究表明凋亡是促使日本血吸蟲在東方田鼠體內(nèi)消亡的主要原因之一，研究中對不同宿主來源童蟲的miRNA進行分析時也發(fā)現(xiàn)部分差異表達的miRNA可能與凋亡調(diào)控相關(guān)。本

6、研究使用凋亡常用的檢測方法TUNEL(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick-end labeling)和DAPI雙染法，定性分析日本血吸蟲14天童蟲蟲體細胞凋亡現(xiàn)象。應(yīng)用Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)(AnnexinV/PI)技術(shù)定量分析14天和23天日本血吸蟲蟲體細胞的凋亡比例，采用商業(yè)化哺乳動物凋亡關(guān)鍵分子Caspase

7、3和Caspase7活性檢測試劑盒檢測日本血吸蟲蟲體Caspase3和Caspase7的活性，結(jié)果顯示童蟲期蟲體的活性高于成蟲，雄性成蟲的活性高于雌性成蟲，相應(yīng)的結(jié)果得到qPCR驗證。研究發(fā)現(xiàn)，廣譜的凋亡抑制劑caspase peptide inhibitor(Z-VAD-FMK)對日本血吸蟲蟲體的Caspase3/7活性有著很好的抑制作用。通過對不同期別日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因的qPCR分析，進一步明確了日本血吸蟲可能存在的凋亡通路。這

8、些結(jié)果為深入探析miRNA在血吸蟲凋亡中的調(diào)節(jié)作用，日本血吸蟲與宿主的相互作用以及開發(fā)抗日本血吸蟲新藥物奠定了基礎(chǔ)。
　　二、日本血吸蟲感染不同適宜性嚙齒類宿主后組織miRNA表達譜變化
　　BALB/c小鼠是日本血吸蟲的適宜宿主。本研究利用miRNA芯片技術(shù)，檢測日本血吸蟲感染前和感染10天后小鼠的miRNA表達譜變化，共檢測到220個miRNA，其中在肝臟、脾臟和肺臟上調(diào)差異表達的分別有8、8和28個，下調(diào)差異表達的分別

9、有3、5和23個。這些差異表達miRNA分子的功能主要集中于免疫應(yīng)答、營養(yǎng)代謝、細胞分化、凋亡及其他信號通路。對這些差異表達miRNA的靶基因進行GO分類和KEGG分析，表明靶基因與多個信號通路有關(guān)，如Toll-like受體信號通路、TGF-β信號通路。研究結(jié)果揭示了miRNA在日本血吸蟲早期感染中可能發(fā)揮了重要的生物學功能，并影響著日本血吸蟲在不同適宜性宿主體內(nèi)的生長發(fā)育及存活。
　　大鼠是日本血吸蟲的非適宜宿主，本研究使用了包

10、含大鼠成熟體miRNA的芯片，分析大鼠在感染血吸蟲前和感染10天后肝臟、脾臟和肺臟的miRNA的表達譜差異。結(jié)果在大鼠肝臟、脾臟和肺臟中分別鑒定了16個、61個和10個差異表達miRNA。對這些差異表達miRNA分析表明，其功能覆蓋了多個生物學過程，如Wnt和MAPK信號傳導、細胞內(nèi)分化和脂肪細胞及紅細胞的分化。研究表明miRNA在血吸蟲感染大鼠中的調(diào)節(jié)作用與在小鼠和東方田鼠中的調(diào)節(jié)作用均存在較大的差別，這最終也影響了血吸蟲在大鼠體內(nèi)的

11、生長發(fā)育狀況。
　　東方田鼠是至今報道的唯一對日本血吸蟲具有天然抗性的哺乳類動物宿主，東方田鼠對日本血吸蟲的天然抗性可能與miRNA介導的基因表達及調(diào)控相關(guān)。HE染色分析表明，東方田鼠感染日本血吸蟲后不同組織病理變化與BALB/c小鼠差異顯著;miRNA芯片分析表明，在東方田鼠和小鼠肝臟、脾臟和肺臟組織中共檢測到388個miRNA，分別有11、25和28個miRNA分子呈現(xiàn)差異表達。這些研究結(jié)果顯示在東方田鼠體內(nèi)miRNA特異性地