燕麥矮縮病毒的RepA蛋白在煙草上誘導(dǎo)HR的機(jī)理研究.pdf

1、病毒和植物的非親和性互作常常導(dǎo)致植物迅速形成有限的細(xì)胞壞死，出現(xiàn)較小的壞死斑，即過(guò)敏性反應(yīng)(hypersensitive response，HR)。燕麥矮縮病毒(Oat dwarfvirus，ODV)是一個(gè)隸屬雙生病毒科玉米線條病毒屬的病毒，病毒基因組為單鏈環(huán)狀的DNA，病毒鏈和互補(bǔ)鏈上共編碼四個(gè)基因(V1、V2、Rep和RepA)。本研究中我們通過(guò)接種ODV侵染性克隆發(fā)現(xiàn)ODV的侵染在煙草上引起了類似HR的反應(yīng)，進(jìn)一步通過(guò)植物雙元表達(dá)

2、載體pCHF3或PVX病毒載體瞬時(shí)表達(dá)ODV的各個(gè)蛋白，發(fā)現(xiàn)只有RepA的表達(dá)在煙草上誘導(dǎo)了細(xì)胞壞死并激發(fā)了H2O2的大量積累，同時(shí)引起HR的標(biāo)志基因HSR203J和HIN1的表達(dá)水平顯著上調(diào)。據(jù)我們所知，這是首次在玉米線條病毒屬病毒中發(fā)現(xiàn)HR的激發(fā)子。圍繞這一重要發(fā)現(xiàn)，我們對(duì)RepA誘導(dǎo)HR的分子機(jī)理開展了深入研究。
　　對(duì)RepA進(jìn)行了一系列缺失突變分析，發(fā)現(xiàn)RepA蛋白的N端1-9位氨基酸在誘導(dǎo)HR方面有重要的作用，中間區(qū)域

3、173位到195位氨基酸及靠近C端的241位到260位氨基酸也是RepA誘導(dǎo)HR所必需的。進(jìn)一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察和免疫膠體金實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了RepA蛋白的亞細(xì)胞定位，證實(shí)它定位于細(xì)胞核中，并且很可能包含有兩個(gè)核定位信號(hào)，但是我們的結(jié)果也顯示這種細(xì)胞核定位對(duì)于其誘導(dǎo)HR來(lái)說(shuō)卻并不是必需的。
　　植物對(duì)有些病原物的防衛(wèi)反應(yīng)受到溫度調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)RepA在30℃以上不能在煙草上誘導(dǎo)HR，表明RepA誘導(dǎo)的HR具有溫度依賴性。同

4、時(shí)，我們還證實(shí)RepA誘導(dǎo)的HR受到信號(hào)分子JA的調(diào)控。外源涂抹茉莉酸甲酯(MeJA)或通過(guò)VIGS沉默COI1(Coronatine-Insensitive1)和AOS(allene oxidesynthase)抑制JA途徑時(shí)，能顯著促進(jìn)或延遲RepA誘導(dǎo)的HR。
　　酵母雙雜交技術(shù)是目前研究蛋白和蛋白相互作用的主要方法。鑒于RepA蛋白在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性，其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域位于C端的199-266位氨基酸這一特性，我們以缺

5、失該結(jié)構(gòu)域的RepA-M3突變體作為誘餌蛋白，運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng)，從包含有本氏煙(Nicotiana benthamiana)的cDNA的酵母文庫(kù)中篩選到20多個(gè)能與RepA互作的候選寄主因子。通過(guò)克隆這些寄主因子的全長(zhǎng)進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，最終確定了S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(NbSAMDC1)是與RepA互作的寄主因子之一。通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)(BiFC)和GST pull down實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明了NbSAMDC1和RepA蛋白在體內(nèi)和體

6、外都存在互作。
　　NbSAMDC1是多胺合成途徑中一個(gè)關(guān)鍵限速酶，在維持植物的SAM/dcSAM平衡中發(fā)揮了重要功能。我們利用qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)RepA蛋白或者接種ODV侵染性克隆都能在本氏煙上誘導(dǎo)包括NbSAMDC1在內(nèi)的多個(gè)多胺合成途徑上相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，與此同時(shí)，利用多胺合成途徑中SAMDC的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑MGBG(Mitoguazone，甲基乙二醛雙脒基腙)處理會(huì)明顯抑制RepA誘導(dǎo)的HR，這揭示了多胺極有可

7、能在RepA誘導(dǎo)HR過(guò)程中作為信號(hào)分子承擔(dān)功能。
　　為了進(jìn)一步了解NbSAMDC1和RepA蛋白互作的生物學(xué)意義，我們通過(guò)病毒載體瞬時(shí)沉默或者過(guò)表達(dá)NbSAMDC1，結(jié)果顯示在NbSAMDC1沉默的本氏煙植株中RepA誘導(dǎo)HR出現(xiàn)了延遲，而在NbSAMDC1過(guò)表達(dá)植株中RepA誘導(dǎo)HR提前，進(jìn)一步在過(guò)表達(dá)NbSAMDC1的轉(zhuǎn)基因植株或通過(guò)RNAi沉默NbSAMDC1的轉(zhuǎn)基因植株上我們獲得了一致的結(jié)果。
　　利用HiSeq2

8、000高通量測(cè)序平臺(tái)我們還分析了RepA誘導(dǎo)HR過(guò)程中的基因表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)RepA瞬時(shí)表達(dá)在本氏煙上引起了4898個(gè)基因顯著上調(diào)，8486個(gè)基因顯著下調(diào)。這些顯著差異表達(dá)基因比對(duì)在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的125條途徑中，其中我們發(fā)現(xiàn)參與光合作用的大部分基因的表達(dá)都受到了顯著抑制，我們選取光合作用途徑上電子傳遞鏈組分NbFDN1進(jìn)行了重點(diǎn)研究。BiFC實(shí)驗(yàn)表明NbFDN1與NbTsip1蛋白在體內(nèi)相互作用，qRT-PCR檢測(cè)表明NbFDN1在Re

9、pA瞬時(shí)表達(dá)72小時(shí)后其表達(dá)水平下調(diào)了7倍，與此相反的是，NbTsip1基因的表達(dá)水平則上調(diào)了約1.5-2.2倍。利用PVX載體過(guò)表達(dá)或VIGS沉默這兩個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)二者均能顯著地改變RepA誘導(dǎo)的HR。通過(guò)電鏡觀察我們發(fā)現(xiàn)RepA的表達(dá)會(huì)造成葉綠體的類囊體降解、淀粉粒數(shù)目減少，表達(dá)譜和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示參與淀粉降解的自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平普遍減少，我們推測(cè)ODV RepA可能是通過(guò)干擾自噬作用來(lái)影響葉綠體和淀粉的降解過(guò)程并進(jìn)而