水稻矮縮病毒（RDV）微核心蛋白P9轉(zhuǎn)錄激活活性的研究.pdf

1、水稻矮縮病毒(Rice dwarfvirus，RDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)的成員。RDV病毒粒子為直徑約70nm的二十面體，基因組由十二條dsRNA組成，根據(jù)它們?cè)诰郾０纺z電泳中的遷移率，由慢到快，依次命名為SI~USl2。RDV可以在它的宿主植物水稻和介體昆蟲(chóng)黑尾葉蟬(Nephotetix cincticps)和電光葉蟬(Recilia dorsalia)中繁殖，并

2、由介體傳播到宿主植物中。 RDV編碼七種結(jié)構(gòu)蛋白和五種非結(jié)構(gòu)蛋白。七種結(jié)構(gòu)蛋白包括P1、P2、P3、P5、P7、P8、P9，分別由S1、S2、S3、S5、S7、S8、S9編碼。五種非結(jié)構(gòu)蛋白包括Pns4、Pns6、Pns10、Pns11、Pnsl2，由S4、S6、S10、S11、S12編碼。用RT-PCR的方法從感病水稻葉片中克隆得到RDV S6，S7，S9和Sl2的基因片斷，分別加上HA-tag和Flag-tag，并將其克隆到

3、植物表達(dá)載體pCAMBIAl 301中，經(jīng)測(cè)序分析確認(rèn)無(wú)誤后，電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后注射Nicotiana benthamiana葉片，3-4天取樣，進(jìn)行Western印跡分析，結(jié)果表明克隆到的基因均有表達(dá)，為進(jìn)一步研究基因的功能奠定了基礎(chǔ)。 將RDV微核心蛋白基因S9克隆到酵母表達(dá)載體pGBKT7中，轉(zhuǎn)入AHl09酵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子可以在SD/Trp<'->His<'->Ade<'->多營(yíng)養(yǎng)缺陷固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，證明RDV P9在酵

4、母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性，運(yùn)用13-半乳糖苷酶的活性分析對(duì)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行定量分析，我們對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)與正對(duì)照(轉(zhuǎn)化pGBK-GAD的Y187)相比，轉(zhuǎn)化pGBK-S9的酵母菌中β-半乳糖苷酶活性可達(dá)到正對(duì)照的30％左右；與負(fù)對(duì)照相比pGBK-S9的酵母菌中β-半乳糖苷酶活性增強(qiáng)了200多倍，這說(shuō)明P9蛋白激活了報(bào)告基因的表達(dá)。 構(gòu)建了含有g(shù)usA報(bào)告基因的植物表達(dá)載體用來(lái)分析P9在植物中的轉(zhuǎn)錄激活活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5、表明，融合GAL4 DBD的P9蛋白可以在植物體內(nèi)激活報(bào)告基因的表達(dá)，采用熒光分光光度法定量測(cè)定三個(gè)效應(yīng)基因第三天在葉片中激活GUS表達(dá)量的情況，融合GAL4 DBD的P9激活GUS強(qiáng)度明顯高于負(fù)對(duì)照，可以達(dá)到正對(duì)照的40％以上，Western印跡法證明P9蛋白在酵母和植物中均可以表達(dá)。進(jìn)一步證明在植物體內(nèi)RDVP9蛋白同樣能夠激活基因的轉(zhuǎn)錄。 為了檢測(cè)RDV P9蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，我們構(gòu)建了RDV P9與GFP的融合水稻