丁苯酞和利魯唑?qū)SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠影響的對比研究.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種選擇性侵犯運動神經(jīng)元的致命性、進行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，表現(xiàn)為上、下運動神經(jīng)元同時受損的混合性癱瘓，臨床表現(xiàn)主要為緩慢進展的四肢無力，患者逐漸喪失運動功能，累及其呼吸肌，導致其因呼吸機麻痹或者并發(fā)呼吸道感染而死亡。ALS預后不良，罹患該病的患者，多于發(fā)病后3至5年內(nèi)死亡。其發(fā)病機制至今尚未完全清楚，可能與神經(jīng)突觸內(nèi)谷氨酸的興奮毒性、氧化應激、神

2、經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、自身免疫反應等多種因素有關(guān)。
　　 目前利魯唑是第一個成功延長患者生命的藥物，可延緩ALS患者氣管切開前時間，及肌無力的惡化程度。但利魯唑不能逆轉(zhuǎn)該病病程，并且價格昂貴，許多患者在用藥過程中因為經(jīng)濟原因而不能堅持用完整個療程，不利于疾病的治療。
　　 丁苯酞(NBP)已應用于急性腦梗死的基礎(chǔ)研究和臨床治療中，并取得了較好的效果。在其作用機制中，它除了能改善缺血區(qū)微循環(huán)和維護線粒體結(jié)構(gòu)和功能以外，還能阻斷缺

3、血性腦損傷多個病理環(huán)節(jié)，亦能抑制細胞凋亡和谷氨酸的釋放等，從而達到神經(jīng)保護的作用。
　　 本實驗旨在比較利魯唑、丁苯酞、兩藥合用這三種不同給藥方法對hSOD1693A轉(zhuǎn)基因鼠的運動功能及生存期的影響及療效差別。轉(zhuǎn)輪實驗、腳印分析及抓力實驗等行為學測定方法可從不同層面評估ALS小鼠的運動功能，而記錄小鼠的存活天數(shù)則用于生存期的比較。通過統(tǒng)計不同組小鼠的上述指標，從而得到該病治療方案的新啟發(fā)。
　　 方法:
　　 1

4、、動物分組及給藥方法
　　 hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠96只，隨機分為丁苯酞+利魯唑組（后稱合用藥組）、利魯唑組、丁苯酞組、對照組，每組24只，雌雄各12只。將丁苯酞純品稀釋于實驗專用玉米油中，制成180mg/ml的丁苯酞溶液備用，于小鼠6周齡時開始，按照180mg/kg的劑量對丁苯酞組小鼠進行灌胃，對照組給予同等量10ml/kg的玉米油，每天一次。利魯唑組按照100ug/ml的濃度溶于小鼠的日常飲用水中，合用組小鼠在丁苯酞灌

5、胃的同時飲用溶有利魯唑的水。
　　 2、行為學觀察:每一組小鼠從第10周起每周進行行為學測定，于90天和120天時記錄下數(shù)據(jù)，測試之前對小鼠進行5天的適應性訓練。
　　 2.1、轉(zhuǎn)輪實驗
　　 將小鼠放在直徑為30mm的滾軸上，設(shè)定好參數(shù)后滾軸開始旋轉(zhuǎn)，在180s內(nèi)轉(zhuǎn)速由1rpm逐漸增至30rpm，每只小鼠重復測定3次，記錄下小鼠在滾軸上持續(xù)運動不掉落的時間（以秒計數(shù)），取最長的一次記錄。
　　 2.2、

6、腳印測量
　　 將小鼠放入長50cm，寬5cm的木制凹槽里面，凹槽底面鋪上長寬與之相當?shù)募垘?，用不同顏色墨汁涂染小鼠的后肢腳掌，使得其在紙帶上跑動時能留下前后掌兩種不同顏色的印跡。然后將小鼠放入凹槽的一端，驅(qū)趕小鼠前進使其運動到另一端，之后找出小鼠留在凹槽底紙帶上的3個連續(xù)跑動時的腳?。▌偲鸩綍r的腳印不選入測量），雙側(cè)腳印各測三個之間的兩段距離，取平均數(shù)作為一側(cè)步長值，然后取左右雙側(cè)步長的平均值記錄。
　　 2.3、抓力

7、測定
　　 用手固定住小鼠背部，讓小鼠后肢抓在抓力儀平板上，測定兩側(cè)后肢抓力值，每側(cè)重復測定3次，取最高數(shù)值記錄，然后取雙側(cè)數(shù)值的平均值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)錄入。
　　 2.4、判定發(fā)病時間
　　 將小鼠放在滾軸上設(shè)定好后開始旋轉(zhuǎn)，在180秒內(nèi)轉(zhuǎn)速由1rpm逐漸增至30rpm，每只小鼠重復測定3次，在180秒內(nèi)老鼠若掉落下來或者后肢明顯震顫，發(fā)現(xiàn)當天記錄為該鼠發(fā)病[1]，發(fā)病時間按小鼠從出生到發(fā)病的天數(shù)計算。
　　

8、 2.5、判定生存期
　　 將小鼠側(cè)臥位放置于不光滑平板上，若小鼠不能在20秒內(nèi)翻轉(zhuǎn)，則判定該小鼠為死亡，當天記錄為小鼠的死亡時間，生存期按小鼠從出生到死亡的天數(shù)計算[2]。
　　 3、組織病理學
　　 用10％水合氯醛將小鼠麻醉后，心臟灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定48h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)組織切片。5μm厚的石蠟切片應用HE染色，觀察脊髓前角神經(jīng)元的存

9、活情況，選取位于脊髓中央管后緣腹側(cè)范圍的前角內(nèi)，符合直徑＞25微米、核仁著色清晰、多角型的神經(jīng)元計數(shù)。
　　 4、統(tǒng)計學分析
　　 所記錄數(shù)據(jù)均以X±SEM來表示，應用統(tǒng)計軟件SPSS13.0版進行統(tǒng)計學分析，用兩個獨立樣本的秩和檢驗或者t檢驗方法進行兩組間比較。病理學結(jié)果應用ANOVA方差分析或秩和檢驗方法進行分析，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、SOD1基因鑒定
　

10、　 子代轉(zhuǎn)基因小鼠由尾端提取出的DNA，經(jīng)過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳后:可見亮度不同條帶，陽性SOD1小鼠的PCR產(chǎn)物為條帶(236bp)，如圖(Fig.1)所見亮條帶，此條帶對應小鼠即為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。
　　 2、各組小鼠的發(fā)病時間與生存期
　　 發(fā)病時間的比較:合用組、丁苯酞組及利魯唑組小鼠發(fā)病時間分別為127.625±2.741天、118.261±2.420天、123.593±1.898天，與對

11、照組106.875±2.298天相比，P值分別為0.000、0.003、0.000，均＜0.05，具有統(tǒng)計學差異。合用組與丁苯酞組相比，P=0.011＜0.05，有統(tǒng)計學差異;合用組與利魯唑組相比，P=0.116＞0.05，差異不具統(tǒng)計學意義;丁苯酞組和利魯唑組相比，P=0.273＞0.05，差異不具統(tǒng)計學意義。
　　 生存時間的比較:合用組、丁苯酞組及利魯唑組小鼠生存時間分別為146.375±2.796天、138.870±2.

12、235天、141.542±2.105天，與對照組124.500±2.354天相比，P值分別為0.000、0.003、0.000，均＜0.05，具有統(tǒng)計學差異。合用組與丁苯酞組相比，P=0.028＜0.05，有統(tǒng)計學差異;合用組與利魯唑組相比，合用組略微優(yōu)于丁苯酞組，P=0.086，沒有統(tǒng)計學差異;丁苯酞組與利魯唑組相比，P=0.465，沒有統(tǒng)計學差異。見Fig2Table1。
　　 3、行為學
　　 3.1、轉(zhuǎn)輪實驗

13、r>　　 90天時，合用組、丁苯酞組及利魯唑組轉(zhuǎn)輪時間分別為180.000±0.000秒、180.000±0.000秒、180.000±0.000秒，與對照組170.875±6.928s相比，P值分別為0.153、0.162、0.153，均＞0.05，不具統(tǒng)計學差異。合用組與丁苯酞組相比，P=1.000＞0.05，兩組間無統(tǒng)計學差異;合用組與利魯唑組小鼠相比，P=1.000＞0.05，兩組相比無統(tǒng)計學差異;利魯唑組與丁苯酞組小鼠相比，

14、P=1.000＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 120天時，合用組、丁苯酞組及利魯唑組轉(zhuǎn)輪時間分別為157.000、±8.530秒、123.826±11.411秒、160.833±7.235秒，與對照組61.167±12.266秒相比較，P值分別為0.000、0.000、0.000，均＜0.05，均具統(tǒng)計學差異。合用組與丁苯酞組相比，P=0.031＜0.05，兩組相比有統(tǒng)計學差異;合用組與利魯唑組小鼠相比，P=0.733＞0

15、.05，兩組相比無統(tǒng)計學差異;利魯唑組與丁苯酞組小鼠相比，P=0.023＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。見Table2。
　　 3.2、腳印分析:
　　 90天時，合用組、丁苯酞組及利魯唑組的后肢步長分別是7.008±0.146、6.798±0.058、6.722±0.109，與對照組6.491±0.092相比，p值分別為0.002、0.016、0.136，合用組、丁苯酞組與對照組的p值均小于0.05，有統(tǒng)計學意義。利魯唑

16、組與對照組相比，P=0.136＞0.05，無統(tǒng)計學意義;合用組與丁苯酞組小鼠相比，P=0.072＞0.05，兩組間無統(tǒng)計學差異;合用組與利魯唑組小鼠相比，P=0.040＜0.05，兩組相比有統(tǒng)計學差異;利魯唑組與丁苯酞組小鼠相比，P=0.784＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 120天時，合用組、丁苯酞組和利魯唑組小鼠的后肢步長分別為6.251±0.214、5.165±0.272、5.679±0.203，與對照組3.423±

17、0.410相比，P值分別為0.000、0.002、0.000均＜0.05，具統(tǒng)計學差異。合用組與丁苯酞組小鼠相比，P=0.003＜0.05，兩組相比有統(tǒng)計學差異;合用組與利魯唑組小鼠相比，P=0.037＜0.05，兩組相比有統(tǒng)計學差異;利魯唑組與丁苯酞組小鼠相比，P=0.159＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。見Table3。
　　 3.3、抓力實驗
　　 90天時，合用組、丁苯酞組、利魯唑組小鼠的后肢抓力分別為71.333

18、±2.519、67.000±1.870、67.417±2.494，與對照組64.167±2.284相比較，P值分別為0.227、0.475、0.584，均＞0.05，不具統(tǒng)計學差異。合用組與丁苯酞組相比，P=0.246＞0.05，兩組間無統(tǒng)計學差異;合用組與利魯唑組小鼠相比，P=0.227＞0.05，兩組相比無統(tǒng)計學差異;利魯唑組與丁苯酞組小鼠相比，P=0.265＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 120天時，合用組、丁苯酞組

19、、利魯唑組小鼠的抓力分別為60.250±2.396、43.217±3.508、50.750±2.817，與對照組26.208±3.788相比較，P值分別為0.006、0.002、0.000，均＜0.05，具統(tǒng)計學差異。合用組與丁苯酞組小鼠相比，P=0.001＜0.05，兩組間有統(tǒng)計學差異;合用組與利魯唑組小鼠相比，P=0.006＜0.05，兩組相比有統(tǒng)計學差異;利魯唑組與丁苯酞組小鼠相比，P=0.101＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。見T

20、able4。
　　 4、病理學
　　 結(jié)果顯示，在癥狀期（即120天）時，合用藥組、丁苯酞組、利魯唑組小鼠的脊髓前腳殘存神經(jīng)元數(shù)分別為16.53±2.264、11.40±1.844、12.87±3.137，與安慰劑組3.67±1.379相比，p值均=0.000＜0.05，具統(tǒng)計學差異。三用藥組之間兩兩比較:合用組與丁苯酞組、利魯唑組比較，p值均=0.000＜0.05，具統(tǒng)計學差異。而丁苯酞組與利魯唑組之間比較，p值=0.