XPB1、ATF6mRNA在家族性肌萎縮側(cè)索硬化模型hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)變化.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的一種，屬于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的范疇，上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元均會(huì)受累，該疾病起病隱匿，發(fā)病前期?？梢猿霈F(xiàn)肢體疲乏、運(yùn)動(dòng)耐力下降等非特異性的癥狀，繼而出現(xiàn)肢體遠(yuǎn)端無(wú)力并逐漸向肢體近端及軀干、頭頸肌肉延伸，出現(xiàn)肢體癱瘓、肌肉萎縮，并最終因呼吸肌無(wú)力致呼吸衰竭或肺部感染而死亡。ALS的發(fā)病率約為1.5/10萬(wàn)，其中約10％的患者具有家族遺傳性(fALS)，另外大部分病例為散發(fā)性(sALS)。肌萎縮側(cè)索硬化癥

2、的發(fā)病機(jī)制涉及多種因素的共同作用，具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的共同特點(diǎn):病因不明、療效不好、預(yù)后不良。
　　 通過(guò)對(duì)占該疾病少數(shù)比例的家族性肌萎縮側(cè)索硬化(fALS)患者研究發(fā)現(xiàn)，fALS中包含多種基因突變，其中銅/鋅過(guò)氧化物歧化酶1(SOD1)基因、TDP-43基因以及FUS/TLS基因突變已經(jīng)被證實(shí)，可以對(duì)一部分ALS的發(fā)病做出解釋。而其中SOD1的基因突變與ALS的相關(guān)性研究最為深入，ALS1是ALS病人中含有SOD1的基因突變的一

3、種亞型，這類患者約占fALS的20％。SOD1基因位于人類21號(hào)染色體上，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，迄今發(fā)現(xiàn)的與ALS有關(guān)的SOD1突變已經(jīng)超過(guò)100種，其上的5個(gè)外顯子中均有突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，主要突變形式為錯(cuò)意和缺失等點(diǎn)突變，這些突變基本以常染色體顯性形式被遺傳?；谝陨蟂OD1基因突變與ALS的相關(guān)性，目前，人類已經(jīng)成功將人SOD1基因轉(zhuǎn)入到小鼠體內(nèi)，培養(yǎng)了hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠，隨著研究的進(jìn)展，該動(dòng)物模型逐漸成熟，已經(jīng)受到國(guó)

4、際上的廣泛認(rèn)可。
　　 關(guān)于ALS的發(fā)病機(jī)制有很多學(xué)說(shuō)，如基因突變、氧化應(yīng)激等學(xué)說(shuō)，最近國(guó)內(nèi)外研究提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激理論。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在于所有哺乳動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)中，它是一個(gè)封閉的、由內(nèi)膜折疊而成的管道系統(tǒng)，因其顯微結(jié)構(gòu)呈網(wǎng)狀，故稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最大的亞細(xì)胞器，承擔(dān)細(xì)胞內(nèi)多種重要的生理功能，同時(shí)也參與到其他細(xì)胞成分如線粒體、細(xì)胞核的病理過(guò)程中。目前對(duì)ALS病人及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究已經(jīng)初步證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與ALS的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

5、　　 正常情況下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以監(jiān)控蛋白質(zhì)的質(zhì)量并參與細(xì)胞內(nèi)的鈣離子調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)源性或外源性的打擊時(shí)，蛋白質(zhì)加工運(yùn)輸發(fā)生紊亂，可以產(chǎn)生大量未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，即表現(xiàn)出未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。當(dāng)錯(cuò)誤蛋白超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷時(shí)，可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，適當(dāng)?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以起到細(xì)胞保護(hù)功能，但細(xì)胞中發(fā)生過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則可以引起細(xì)胞功能障礙，甚至細(xì)胞凋亡。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有三種跨膜蛋白，分別為IRE1(i

6、nositol-requiring enzyme1)、ATF6(activating transcription factor6)和PERK(PKR-like ER kinase)。發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，這三種蛋白分別與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78/BIP分離而被激活，繼而分別介導(dǎo)三條通路。其中活化的IRE-1產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性，對(duì)其下游XBP1的前體mRNA進(jìn)行剪接，編碼剪接的XBP1(sXBP1)蛋白，而活化的ATF6被轉(zhuǎn)移到高爾基體水解形

7、成的活化的p50-ATF6。sXBP1及p50-ATF6可以進(jìn)入細(xì)胞核，激活ERS反應(yīng)元件(ER stress response element，ERSE)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)錯(cuò)誤蛋白的正確折疊。PERK通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)而磷酸化轉(zhuǎn)錄起始因子eIF2α，使細(xì)胞中廣泛的蛋白正常翻譯下調(diào)，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理蛋白的負(fù)荷。
　　 本實(shí)驗(yàn)小組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，三條通路上均有相應(yīng)指標(biāo)

8、（sXBP1、p50-ATF6、p-eIF2α等）蛋白水平的改變，本實(shí)驗(yàn)旨通過(guò)對(duì)hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠中XBP1、sXBP1及ATF6等的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定，以期了解各內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中相關(guān)指標(biāo)的變化，并了解應(yīng)激起始于mRNA水平，或起自蛋白水平。
　　 方法:
　　 第一部分:實(shí)驗(yàn)小鼠的獲得及基因篩定
　　 選取半合子雄鼠B6SJL-Tg（SOD1-G93A）1Gur/J與B6SJLF1/

9、J+/+的雌鼠進(jìn)行配種，獲得子代小鼠，用剪取少許小鼠尾尖的方法，獲取子代小鼠的DNA，利用PCR反應(yīng)進(jìn)行突變基因的擴(kuò)增，并采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析，分別得到含有hSOD1G93A突變基因的陽(yáng)性小鼠及不含該突變基因的陰性小鼠。
　　 第二部分:hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓細(xì)胞中XBP1、sXBP1及ATF6的mRNA的變化研究
　　 1、分組:對(duì)鑒定后得到的hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為的觀察及分組，

10、分為出生28天組、35天組、49天組、63天組、癥狀早期（約90天）組及終末期（約120天）組，并分別取同期同窩基因鑒定為陰性的小鼠做對(duì)照。
　　 2、實(shí)驗(yàn)取材:按照各分組的時(shí)間，腹腔注射10％水合氯醛進(jìn)行小鼠麻醉，然后快速取小鼠腰髓，迅速液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 3、實(shí)時(shí)定量RT-PCR:采用Trizol試劑法提取小鼠腰髓總RNA，測(cè)取RNA濃度，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而以cDNA為模板利用XBP

11、1、sXBP1及ATF6的特異性引物，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR的方法分別進(jìn)行擴(kuò)增。觀察以上各指標(biāo)的mRNA在各組小鼠腰髓中的含量變化。
　　 結(jié)果:實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示:XBP1、sXBP1的mRNA在癥狀早期和終末期的轉(zhuǎn)基因小鼠組與同期對(duì)照組相比表達(dá)增高，癥狀早期增高更為明顯。而ATF6的mRNA在各轉(zhuǎn)基因組與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異，且在不同時(shí)期轉(zhuǎn)基因組之間和不同時(shí)期對(duì)照組之間均未見(jiàn)明顯差異。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通