肌萎縮側(cè)索硬化體外培養(yǎng)模型的建立.pdf

1、河北醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文肌萎縮側(cè)索硬化體外培養(yǎng)模型的建立姓名：肖向建申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：李春巖20050401中文摘要因此，較單運動神經(jīng)元培養(yǎng)更適合研究ALS。我們分別利用腦片和脊髓片的培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)合谷氨酸的慢性興奮毒性作用機制，制備ALS的器官型培養(yǎng)模型，并進一步探討膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)在該模型中對運動神經(jīng)元的保護作用口論文共分四部分:第一部分建立大鼠運動區(qū)腦片的培養(yǎng)方法，并將培養(yǎng)的腦片與在體內(nèi)生長至

2、同時期的運動皮層對比第二部分根據(jù)谷氨酸的興奮毒機制，利用谷氨酸轉(zhuǎn)運體抑制劑蘇一輕天冬氨酸(THA)制作運動皮層大錐體細胞損傷的腦片培養(yǎng)模型第三部分利用脊髓片的器官培養(yǎng)技術(shù)，用谷氨酸轉(zhuǎn)運體抑制劑蘇一輕天冬氨酸制作脊髓腹角運動神經(jīng)元損傷而中間神經(jīng)元不受影響的脊髓器官型培養(yǎng)模型第四部分觀察GDNF對THA介導(dǎo)的上、下運動神經(jīng)元損傷的保護作用。第一部分大鼠腦片的培養(yǎng)及運動皮層錐體細胞的組化鑒定目的:建_t.大鼠運動區(qū)腦片的培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)用抗非磷酸

3、化神經(jīng)絲抗體(SMI32)對大腦皮層大錐體細胞進行免疫組化鑒定和計數(shù)，并比較培養(yǎng)腦片中大錐體細胞數(shù)目與同齡大鼠體內(nèi)生長的大錐體細胞數(shù)目，建立穩(wěn)定的能模擬體內(nèi)生長環(huán)境的腦片培養(yǎng)模型。方法:腦片的培養(yǎng)用1日齡SD大鼠，在無菌條件下快速分離、取出完整大腦，用手術(shù)刀沿正中線將其切為左右兩半，分別用McIIwain組織切片機將額頂葉切成350um厚的冠狀切片，將切片轉(zhuǎn)移到4℃的GBSS中，在解剖顯微鏡下分離成單片。從額極開始的前3片(士1.05m

4、m)棄除，從第4片開始連續(xù)取3片切片。6孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔放入1ml培養(yǎng)基ms，每孔放置1個MillicellCMinsert，用吸管將完好的腦片轉(zhuǎn)移至insert上，每個insertI放3片，移去，nsert膜表面多余的培養(yǎng)液，入C02培養(yǎng)箱(370C，5%C0295%空氣)培養(yǎng)，驚周換液2次。分別在培養(yǎng)2周、3周、4周和5周時將腦片取出，SMI32免疫組化染色，200X光鏡下對大錐體細胞計數(shù)，并測定各時間點培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含