健脾益肺方對(duì)hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響.pdf

1、目的:
　　肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種罕見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為肌無力、肌萎縮，伴構(gòu)音障礙、吞咽困難等，最終呼吸衰竭，目前缺乏特效治療方法。本研究擬采用hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠，給予不同濃度健脾益肺方灌胃處理，并通過評(píng)估其體重變化、運(yùn)動(dòng)功能、生存期等指標(biāo)觀察健脾益肺方的療效;應(yīng)用組織免疫熒光，檢測(cè)腰段脊髓前角神經(jīng)元核蛋白(Neuronal Nuclei，NeuN

2、)、小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物整合素α M(CD11b)及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B p65的熒光情況，初步探討健脾益肺方對(duì)ALS模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.將hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為:生理鹽水組、低濃度健脾益肺方組、中濃度健脾益肺方組和高濃度健脾益肺方組;同窩普通野生型小鼠設(shè)為陰性對(duì)照組。每組小鼠6只。模型小鼠按分組予生理鹽水或?qū)?yīng)濃度健脾益肺方灌胃，陰性對(duì)照組予等量生理鹽水灌胃。

3、每日灌胃一次。
　　2.測(cè)定小鼠體重，通過Weydt評(píng)分確定發(fā)病時(shí)間及生存期，通過懸尾試驗(yàn)、衣架懸掛試驗(yàn)、疲勞轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)等評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能。統(tǒng)計(jì)分析各組間差異。
　　3.各組小鼠終末期經(jīng)取材、固定、冰凍切片后，進(jìn)行免疫熒光染色。正置熒光顯微鏡×40倍物鏡下觀察并拍照。利用Image J軟件測(cè)定前角NeuN陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD11b陽性活化小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)及NF-κ B p65熒光強(qiáng)度核/漿比。統(tǒng)計(jì)分析各組間差異。
　　結(jié)果:

4、r>　　1.體重變化
　　治療前，生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠體重差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療后，前期四組模型小鼠的體重隨時(shí)間均呈增加趨勢(shì)，增加幅度基本無差異。16周齡開始，各組體重差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與生理鹽水組模型小鼠比較，低濃度健脾益肺方組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠體重下降幅度明顯延緩，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05、P＜0

5、.01)。
　　2.發(fā)病期和生存期
　　生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠的發(fā)病時(shí)間依次為:(88.83±4.12)天、(101.33±5.75)天、(108.83±6.68)天、(113.50±10.74)天。與生理鹽水組比較，低濃度健脾益肺方組發(fā)病時(shí)間沒有明顯差異，中濃度和高濃度健脾益肺方組模型小鼠的發(fā)病時(shí)間明顯延遲，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.986、0.035、0.001)。生理鹽水組和低濃度、中

6、濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠的生存期依次為:(125.17±3.71)天、(132.17±2.93)天、(138.50±5.05)天、(143.83±3.97)天。與生理鹽水組比較，低濃度、中濃度和高濃度健脾益肺方組的生存期顯著延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017、0.000、0.000)。
　　3.運(yùn)動(dòng)功能:
　　衣架懸掛試驗(yàn):9-14周齡，生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠掉落次數(shù)處于低水平的

7、穩(wěn)定狀態(tài)，各組沒有明顯差異。15-16周齡，生理鹽水組掉落次數(shù)迅速增多，同時(shí)期健脾益肺方組情況基本穩(wěn)定。17周齡開始，生理鹽水組模型小鼠不能耐受試驗(yàn)，健脾益肺方組掉落次數(shù)迅速增多。與生理鹽水組模型小鼠比較，低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組掉落次數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)。
　　疲勞轉(zhuǎn)棒試驗(yàn):9-13周齡，生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠掉落次數(shù)處于低水平的穩(wěn)定狀態(tài)，各組沒有明顯差異。14-

8、17周齡，生理鹽水組掉落次數(shù)迅速增多，同時(shí)期，健脾益肺方組模型小鼠情況基本穩(wěn)定。18周齡開始，生理鹽水組模型小鼠不能耐受試驗(yàn)，同時(shí)期的健脾益肺方組掉落次數(shù)迅速增多。與生理鹽水組模型小鼠比較，低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組掉落次數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.NeuN陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠依次為:(3.83±0.98)個(gè)/視野、(4.17±1.17)個(gè)

9、/視野、(4.83±1.17)個(gè)/視野、(7.83±1.17)個(gè)/視野。陰性對(duì)照組為:(9.17±0.75)個(gè)/視野。與陰性對(duì)照組比較，生理鹽水組模型小鼠前角NeuN陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與生理鹽水組模型小鼠比較，低濃度、中濃度健脾益肺方組模型小鼠的NeuN陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高濃度組明顯增多，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　5.CD11b免疫熒光表達(dá)
　　激活型小

10、膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù):生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠的CD11b陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞體呈不同程度地增大，細(xì)胞突起增粗、變短，呈激活的小膠質(zhì)細(xì)胞。CD11b陽性細(xì)胞激活型小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)依次為:(17.50±1.05)個(gè)/視野、(15.00±1.41)個(gè)/視野、(12.33±1.63)個(gè)/視野、(9.17±1.47)個(gè)/視野。陰性對(duì)照組為:(0.33±0.52)個(gè)/視野。與陰性對(duì)照組比較，生理鹽水組模型小鼠激活型小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)明

11、顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與生理鹽水組模型小鼠比較，低濃度、中濃度和高濃度健脾益肺方組模型小鼠的CD11b陽性激活型小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。
　　激活型小膠質(zhì)細(xì)胞占比:生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠的CD11b陽性細(xì)胞中激活型小膠質(zhì)細(xì)胞占小膠質(zhì)細(xì)胞總計(jì)數(shù)比值依次為:(19.15±1.67)％、(16.67±1.76)％、(1

12、3.35±1.61)％、(10.05±1.80)％。陰性對(duì)照組為:(0.35±0.55)％。與陰性對(duì)照組比較，生理鹽水組模型小鼠的激活型小膠質(zhì)細(xì)胞占比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與生理鹽水組模型小鼠比較，低濃度健脾益肺方組模型小鼠無明顯差異(P=0.052)，而中濃度、高濃度健脾益肺方組激活型小膠質(zhì)細(xì)胞占比明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　6.NF-κB p65免疫熒光強(qiáng)度核/漿比
　　

13、生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠依次為:(1.389±0.035)％、(1.394±0.020)％、(1.211±0.059)％、(1.206±0.056)％。陰性對(duì)照組為:(20.42±5.10)％。與陰性對(duì)照組比較，生理鹽水組模型小鼠的p65熒光強(qiáng)度核/漿比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與生理鹽水組模型小鼠比較，低濃度健脾益肺方組無明顯差異(P=0.995)，中濃度和高濃度健脾益肺方組均明顯下降

14、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病后體重下降嚴(yán)重，運(yùn)動(dòng)功能減退，生存期縮短;健脾益肺方治療hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠能延緩發(fā)病時(shí)間，延長(zhǎng)生存期，保持體重，改善運(yùn)動(dòng)功能。
　　2.hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病后存在腰段脊髓前角神經(jīng)細(xì)胞丟失、小膠質(zhì)細(xì)胞活化增生和NF-κ B p65核轉(zhuǎn)移程度增高;高濃度健脾益肺方能減輕模型小鼠脊髓神經(jīng)元丟失情況;中、高濃