運動神經(jīng)元細胞中hSOD1-G93A基因?qū)BK1的影響.pdf

1、目的：肌萎縮側索硬化（ALS）是一種致命的、進行性的運動神經(jīng)元變性病，以運動神經(jīng)元的功能缺失為主要特征。超氧化物岐化酶1（SOD1）突變假說在ALS發(fā)病機制中占有重要地位，尤以突變基因研究最為廣泛。本實驗以hSOD1-G93A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染運動神經(jīng)元雜交瘤細胞（NSC34），探索突變SOD1對TANK結合蛋白激酶1（TANK-Binding Kinas,1，TBK1）的影響，為以后的研究打下基礎。TBK1是一種廣泛表達的蛋白激酶，在細胞的多種

2、生物學功能中發(fā)揮著重要作用。TBK1是一種非典型的IΚB激酶（IKK）相關的蛋白激酶。TBK1由729個氨基酸組成，包含4個功能結構域：N末端結構域，泛素樣結構域和兩個 C末端結構域（亮氨酸拉鏈和螺旋-環(huán)-螺旋模體）。TBK1在自噬中起著重要作用，此外也參與固有免疫，清除細菌，抑制細胞生長和增殖。
　　方法：
　　1.實驗分組
　　本研究中使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 hSOD1-G3A(突變組)的 NSC-34細胞系作為ALS細胞模

3、型，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（Empty）、hSOD1-野生型（WT）的NSC-34細胞系作為對照組。
　　2.藥物干預
　　空質(zhì)粒組、野生型組和突變組三種細胞系以相似的密度接種于孔板中，分別加入自噬阻斷劑巴菲羅霉素A（Bafilomycin A）和蛋白酶體阻斷劑MG132。然后分別通過細胞計數(shù)試劑盒（cck-8）檢測細胞活力；激光共聚焦顯微鏡觀察SOD1突變對pTBK1表達數(shù)量的影響；Western Blot檢測SOD1、TBK1、

4、pTBK1以及自噬相關蛋白P62、LC3B-II的表達情況。
　　結果:
　　1.巴菲羅霉素A和MG132均降低三種細胞的細胞活力，但突變組較空質(zhì)粒組和野生型組下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義；2.應用激光共聚焦顯微鏡觀察突變組給予自噬阻斷劑后較空質(zhì)粒組pTBK1表達數(shù)量降低。3.Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)Bafilomycin A增加自噬相關蛋白P62、LC3B-II的表達水平，此外干預后突變組pTBK1的表達水平較空質(zhì)粒

5、組降低，差異有統(tǒng)計學意義；空質(zhì)粒組總的TBK1給予Bafilomycin A后增多（P<0.05），但突變組未見明顯變化。MG132干預后 P62、LC3B-II增多，但突變組pTBK1水平較空質(zhì)粒組降低，總的TBK1水平?jīng)]有變化。
　　結論：
　　1.突變的SOD1通過自噬和蛋白酶體通路降解。
　　2.巴菲羅霉素A干預后，突變組pTBK1較空質(zhì)粒組降低，說明SOD1突變阻礙TBK1的活化。空質(zhì)粒組總的TBK1在給予自