FGF-2對SOD1G93A轉基因小鼠發(fā)病機制作用的研究.pdf

1、目的:肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種致命性的神經退行性疾病。它是運動神經元病(MND)中最常見的類型，特點為上運動神經元與下運動神經元同時受累，主要累及脊髓前角細胞、小腦運動神經元等并導致神經元細胞變性死亡[1]。主要臨床表現為進行性加重的骨骼肌無力與萎縮等，60％以上患者在起病3年內死亡，約有10％生存期可達8年以上[2]。ALS中約有5-10％為家族性ALS(famili

2、al ALS，fALS)[3]，其余患者為散發(fā)性ALS(sporadic ALS，sALS)，無家族史。其中大約有fALS中的10-20％和sALS中的4％都和銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxide dismutase1，SOD1)的突變有關[4，5]。ALS的發(fā)病機制到目前為止還尚未完全明確，在過去的相關研究中研究人員根據各方面的研究成果提出了很多種假說，包括谷氨酸興奮毒性、氧化應激、蛋白的異常折疊和聚集、線粒體損傷、自身

3、免疫機制以及營養(yǎng)因子缺乏等[6，7]。
　　成纖維生長因子2(Fibroblast growth factor2，FGF-2)是一種神經營養(yǎng)因子，是成纖維生長因子的一種，它在細胞的復制、分化等起到調節(jié)作用[8,9]，在神經系統(tǒng)中具有廣泛的作用，表達于多種細胞類型，包括神經元細胞和神經膠質細胞等[8，10]。FGF-2在大腦損傷后和多種神經細胞中受調控的神經保護作用中出現上調[9]。已經有實驗證實敲除FGF-2的SOD1G93A小鼠

4、的可觀察到發(fā)病推遲、生存期延長、癥狀相對較輕等[11]。
　　本研究在此基礎上利用ALS轉基因模型，即SOD1G93A小鼠，來研究SOD1G93A小鼠癥狀早起及癥狀終末期大腦皮層、小腦、腰段脊髓以及肌肉組織中FGF-2的表達差異，進行western bloting和熒光定量PCR實驗驗證表達譜結果，探索ALS疾病中各個組織中FGF-2的表達變化，探討其在該病的發(fā)生發(fā)展中起到的作用及意義。
　　方法:
　　1、轉基因鼠的

5、繁殖
　　所有本實驗中使用到的小鼠全都在恆溫、恆濕、無特定病原菌(specificpathogen free，SPF)的環(huán)境中飼養(yǎng)，使用SPF級顆粒型鼠類飼料和無菌水喂養(yǎng)。為了B6 SJL.TgN(SOD1G93A)1Gur轉基因小鼠突變基因穩(wěn)定下傳的維持，使用B6SJLSOD1G93A/+雜合子雄鼠與B6SJLF1/J雜合子雌鼠進行交配繁殖，這兩種小鼠均購買于美國Jackson實驗室(Bar Harbor, ME，USA)。密切

6、觀察小鼠，并于小鼠3-4周時剪取子代鼠尾尖部組織進行基因鑒定，以明確其是否攜帶有人突變SOD1(hSOD1)基因。
　　2、實驗分組
　　實驗分為實驗組和同窩對照組。實驗組為隨機選取不同時期的SOD1G93A雌性轉基因小鼠，同窩對照組分別為雌性非轉基因同窩小鼠。取癥狀終末期各組小鼠各3只用于進行免疫印跡實驗，取30天、60天、90天及癥狀終末期各組小鼠各3只用于進行熒光定量PCR實驗。
　　3、試驗方法
　　3.

7、1取材
　　各個時期的各組小鼠用百分之十的水合氯醛進行腹腔內注射麻醉后，分別以4％多聚甲醛灌流固定保存或新鮮取大腦皮層、小腦、腦髓和肌肉組織并迅速投入液氮速凍后于.80℃冰箱保存。其中用于western blot實驗的小鼠進行新鮮取材。用于RT-PCR的小鼠進行固定保存。
　　3.2免疫印跡(Western blotting)
　　分別提取大腦皮層、小腦、腰髓以及后腿肌肉總蛋白，用BCA法測蛋白濃度。使用10％或12％

8、SDS，進行PAGE電泳后，使用PVDF膜進行轉膜，使用PBS稀釋過的5％的脫脂奶粉室溫封閉1小時，再分別加入鼠抗GAPDH抗體(1∶500)和兔抗FGF2抗體(1∶500)。4℃環(huán)境搖床中過夜。第二天，先使用TPBS洗3次，每次持續(xù)5分鐘左右。再分別加入抗鼠和抗兔熒光二抗(1∶10000)室溫孵育1小時，然后用TPBS洗3次，PBS洗1次，每次5分鐘。再用Odyssey紅外掃描儀（美國LI.COR公司）掃膜并且分析其結果。最后，計算需

9、要的目的條帶和GAPDH灰度的比值并且再進行相關的統(tǒng)計學處理。
　　3.3熒光定量PCR
　　進行小鼠脊髓腰段的新鮮取材，迅速置于液氮中，于-80℃冰箱中保存。提取樣本的RNA并且進行反轉錄后，再使用Stratagene Mx3005P熒光定量PCR儀擴增實驗所需的目的基因。
　　3.4統(tǒng)計學分析
　　計量資料用x±s表示，采用SPSS13.O軟件進行統(tǒng)計學處理，統(tǒng)計方法為成組數據的t檢驗，各時期間比較采用Stu

10、dent-Newman-Keuls檢測。采用檢驗水準a=0.05，P＜0.05為有差異，有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、轉基因鼠的鑒定
　　子代小鼠基因鑒定結果:對待檢小鼠基因組PCR產物進行電泳，內參照IL.2的條帶(324 bp)位于300.400bp之間;突變SOD1基因的條帶(236bp)位于200.300bp之間。對PCR產物進行純化測序，以確定其片段大小為236bp，證實其為hSOD1基因目的條帶，存在

11、G93A位點(GCT替代GGT)突變。
　　2、目的蛋白的表達
　　轉基因小鼠中陽性小鼠較對照組陰性小鼠肌肉組織中FGF-2的含量增加(P＜0.05），其他部位含量沒有顯著變化。
　　3、RT-PCR結果
　　我們檢測了不同時期轉基因小鼠大腦皮層、小腦、腰段脊髓及肌肉中FGF2 mRNA的表達。與同窩對照相比，SOD1 G93A轉基因小鼠在30天，60天，120天以及癥狀終末期脊髓中FGF-2基因表達均無明顯變化