FGF-2對SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病機制作用的研究.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種致命性的神經(jīng)退行性疾病。它是運動神經(jīng)元病(MND)中最常見的類型，特點為上運動神經(jīng)元與下運動神經(jīng)元同時受累，主要累及脊髓前角細(xì)胞、小腦運動神經(jīng)元等并導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞變性死亡[1]。主要臨床表現(xiàn)為進行性加重的骨骼肌無力與萎縮等，60％以上患者在起病3年內(nèi)死亡，約有10％生存期可達(dá)8年以上[2]。ALS中約有5-10％為家族性ALS(famili

2、al ALS，fALS)[3]，其余患者為散發(fā)性ALS(sporadic ALS，sALS)，無家族史。其中大約有fALS中的10-20％和sALS中的4％都和銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxide dismutase1，SOD1)的突變有關(guān)[4，5]。ALS的發(fā)病機制到目前為止還尚未完全明確，在過去的相關(guān)研究中研究人員根據(jù)各方面的研究成果提出了很多種假說，包括谷氨酸興奮毒性、氧化應(yīng)激、蛋白的異常折疊和聚集、線粒體損傷、自身

3、免疫機制以及營養(yǎng)因子缺乏等[6，7]。
　　成纖維生長因子2(Fibroblast growth factor2，F(xiàn)GF-2)是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，是成纖維生長因子的一種，它在細(xì)胞的復(fù)制、分化等起到調(diào)節(jié)作用[8,9]，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛的作用，表達(dá)于多種細(xì)胞類型，包括神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等[8，10]。FGF-2在大腦損傷后和多種神經(jīng)細(xì)胞中受調(diào)控的神經(jīng)保護作用中出現(xiàn)上調(diào)[9]。已經(jīng)有實驗證實敲除FGF-2的SOD1G93A小鼠

4、的可觀察到發(fā)病推遲、生存期延長、癥狀相對較輕等[11]。
　　本研究在此基礎(chǔ)上利用ALS轉(zhuǎn)基因模型，即SOD1G93A小鼠，來研究SOD1G93A小鼠癥狀早起及癥狀終末期大腦皮層、小腦、腰段脊髓以及肌肉組織中FGF-2的表達(dá)差異，進行western bloting和熒光定量PCR實驗驗證表達(dá)譜結(jié)果，探索ALS疾病中各個組織中FGF-2的表達(dá)變化，探討其在該病的發(fā)生發(fā)展中起到的作用及意義。
　　方法:
　　1、轉(zhuǎn)基因鼠的

5、繁殖
　　所有本實驗中使用到的小鼠全都在恆溫、恆濕、無特定病原菌(specificpathogen free，SPF)的環(huán)境中飼養(yǎng)，使用SPF級顆粒型鼠類飼料和無菌水喂養(yǎng)。為了B6 SJL.TgN(SOD1G93A)1Gur轉(zhuǎn)基因小鼠突變基因穩(wěn)定下傳的維持，使用B6SJLSOD1G93A/+雜合子雄鼠與B6SJLF1/J雜合子雌鼠進行交配繁殖，這兩種小鼠均購買于美國Jackson實驗室(Bar Harbor, ME，USA)。密切

6、觀察小鼠，并于小鼠3-4周時剪取子代鼠尾尖部組織進行基因鑒定，以明確其是否攜帶有人突變SOD1(hSOD1)基因。
　　2、實驗分組
　　實驗分為實驗組和同窩對照組。實驗組為隨機選取不同時期的SOD1G93A雌性轉(zhuǎn)基因小鼠，同窩對照組分別為雌性非轉(zhuǎn)基因同窩小鼠。取癥狀終末期各組小鼠各3只用于進行免疫印跡實驗，取30天、60天、90天及癥狀終末期各組小鼠各3只用于進行熒光定量PCR實驗。
　　3、試驗方法
　　3.

7、1取材
　　各個時期的各組小鼠用百分之十的水合氯醛進行腹腔內(nèi)注射麻醉后，分別以4％多聚甲醛灌流固定保存或新鮮取大腦皮層、小腦、腦髓和肌肉組織并迅速投入液氮速凍后于.80℃冰箱保存。其中用于western blot實驗的小鼠進行新鮮取材。用于RT-PCR的小鼠進行固定保存。
　　3.2免疫印跡(Western blotting)
　　分別提取大腦皮層、小腦、腰髓以及后腿肌肉總蛋白，用BCA法測蛋白濃度。使用10％或12％

8、SDS，進行PAGE電泳后，使用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，使用PBS稀釋過的5％的脫脂奶粉室溫封閉1小時，再分別加入鼠抗GAPDH抗體(1∶500)和兔抗FGF2抗體(1∶500)。4℃環(huán)境搖床中過夜。第二天，先使用TPBS洗3次，每次持續(xù)5分鐘左右。再分別加入抗鼠和抗兔熒光二抗(1∶10000)室溫孵育1小時，然后用TPBS洗3次，PBS洗1次，每次5分鐘。再用Odyssey紅外掃描儀（美國LI.COR公司）掃膜并且分析其結(jié)果。最后，計算需

9、要的目的條帶和GAPDH灰度的比值并且再進行相關(guān)的統(tǒng)計學(xué)處理。
　　3.3熒光定量PCR
　　進行小鼠脊髓腰段的新鮮取材，迅速置于液氮中，于-80℃冰箱中保存。提取樣本的RNA并且進行反轉(zhuǎn)錄后，再使用Stratagene Mx3005P熒光定量PCR儀擴增實驗所需的目的基因。
　　3.4統(tǒng)計學(xué)分析
　　計量資料用x±s表示，采用SPSS13.O軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計方法為成組數(shù)據(jù)的t檢驗，各時期間比較采用Stu

10、dent-Newman-Keuls檢測。采用檢驗水準(zhǔn)a=0.05，P＜0.05為有差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定
　　子代小鼠基因鑒定結(jié)果:對待檢小鼠基因組PCR產(chǎn)物進行電泳，內(nèi)參照IL.2的條帶(324 bp)位于300.400bp之間;突變SOD1基因的條帶(236bp)位于200.300bp之間。對PCR產(chǎn)物進行純化測序，以確定其片段大小為236bp，證實其為hSOD1基因目的條帶，存在

11、G93A位點(GCT替代GGT)突變。
　　2、目的蛋白的表達(dá)
　　轉(zhuǎn)基因小鼠中陽性小鼠較對照組陰性小鼠肌肉組織中FGF-2的含量增加(P＜0.05），其他部位含量沒有顯著變化。
　　3、RT-PCR結(jié)果
　　我們檢測了不同時期轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層、小腦、腰段脊髓及肌肉中FGF2 mRNA的表達(dá)。與同窩對照相比，SOD1 G93A轉(zhuǎn)基因小鼠在30天，60天，120天以及癥狀終末期脊髓中FGF-2基因表達(dá)均無明顯變化