芳基硫酸酯酶B的表達(dá)與分布與SOD1 G93A轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元死亡的相關(guān)性研究.pdf

1、背景與目的：
　　肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種以進(jìn)行性和選擇性損傷的上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元為主的慢性的致命性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，病變主要累及大腦皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、脊髓前角細(xì)胞及腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核。ALS起病隱匿、預(yù)后很差，患者常在3-5年內(nèi)死于呼吸肌麻痹，目前尚無(wú)特異的診斷和治療方法。若能找到敏感的疾病相關(guān)蛋白，不僅能早期診斷ALS、跟蹤疾病進(jìn)展、評(píng)估治療后的反應(yīng)，還能幫助我們更好地理解ALS的分子發(fā)病機(jī)制。但目前已發(fā)現(xiàn)的致病蛋白只能部分解釋肌

2、萎縮側(cè)索硬化癥的可能發(fā)病機(jī)制。因此，這項(xiàng)研究主要為了尋找與肌萎縮側(cè)索硬化癥發(fā)病相關(guān)的新蛋白。
　　前期我們通過(guò)對(duì)SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的腦和脊髓進(jìn)行蛋白組學(xué)分析找出差異蛋白，然后通過(guò)觀察野生型和SOD1 G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓在不同發(fā)病階段脊髓節(jié)段、區(qū)域以及神經(jīng)細(xì)胞中ARSB的表達(dá)和分布情況以便達(dá)到初步揭示ARSB在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中分布規(guī)律，證實(shí)ARSB是ALS可能的疾病相關(guān)蛋白。
　　方法：

3、　　通過(guò)構(gòu)建B6SJL-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，通過(guò)與正常的C57BL/6J交配繁殖，用PCR技術(shù)檢測(cè)和篩選出SOD1-G93A陽(yáng)性子代小鼠，進(jìn)行ALS差異蛋白ARSB的驗(yàn)證：
　?。?）Western blot的研究對(duì)象
　　12只小鼠，包括：攜帶SOD1-G93A基因的可發(fā)病1代9只小鼠，為實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分及年齡分為3個(gè)亞組：①未發(fā)病組（60-70天）；②發(fā)病組（90-10

4、0天）；③進(jìn)展組（120-130天）。每組均為3只，正常野生型B6小鼠3只為為正常對(duì)照組，其鼠齡均為60-70天。
　?。?）Western blot實(shí)驗(yàn)
　　剝?nèi)?2只小鼠的脊髓，提取小鼠的脊髓蛋白并進(jìn)行濃度檢測(cè)。每次Western blot將比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組共4只小鼠脊髓中的ARSB蛋白表達(dá)水平，重復(fù)3次。運(yùn)用Quantity One軟件作相對(duì)光密度分析。
　?。?）免疫熒光實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象
　　18只小鼠，

5、包括：攜帶SOD1-G93A基因的可發(fā)病1代小鼠9只為實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)小鼠神經(jīng)功能評(píng)分及年齡分為3個(gè)亞組：未發(fā)病組、發(fā)病組、進(jìn)展組，每組3只；正常野生型B6小鼠9只為正常對(duì)照組，3個(gè)亞組按年齡分為：60-70天，90-100天，120-130天，每組3只。
　?。?）免疫熒光實(shí)驗(yàn)
　　剝?nèi)?8只小鼠脊髓，制作冰凍切片，每組每一只小鼠的脊髓切片分別分為頸段、胸段及腰段。
　　免疫熒光單標(biāo)實(shí)驗(yàn)：每個(gè)節(jié)段共觀察9張脊髓切片。針對(duì)

6、每張切片，在熒光顯微鏡4×、10×、20×、40×放大倍數(shù)下觀察脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)內(nèi)ARSB陽(yáng)性細(xì)胞分布的概況；對(duì)有ARSB陽(yáng)性細(xì)胞分布的脊髓灰質(zhì)，按照不同解剖區(qū)域，在20×放大倍數(shù)下對(duì)2個(gè)灰質(zhì)前角、2個(gè)灰質(zhì)后角及中央管周?chē)魅?個(gè)視野（即對(duì)一張脊髓切片共取5個(gè)視野），運(yùn)用Image-Pro Plus6.0軟件，分析ARSB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。
　?。?）統(tǒng)計(jì)分析和圖像處理
　　通過(guò)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，所

7、有數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示，采用析因設(shè)計(jì)方差分析法來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩相比較采用Bonferroni法， P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　ALS差異蛋白ARSB的驗(yàn)證結(jié)果：
　?。?）Western blot的驗(yàn)證結(jié)果
　　在ARSB的表達(dá)中對(duì)照組<實(shí)驗(yàn)組，且實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)隨病情的進(jìn)展而上調(diào)。
　　（2）免疫熒光實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果
　　ARSB陽(yáng)性細(xì)胞廣泛存在于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的脊髓灰質(zhì)內(nèi)，在脊

8、髓白質(zhì)內(nèi)ARSB陽(yáng)性細(xì)胞的未見(jiàn)表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)組小鼠脊髓ARSB陽(yáng)性細(xì)胞的分布特征：在實(shí)驗(yàn)組小鼠的頸段，在中央管周?chē)?、灰質(zhì)前角和灰質(zhì)后角區(qū)域，不同疾病階段的小鼠，其ARSB陽(yáng)性細(xì)胞百分率有顯著差異，且隨病情的進(jìn)展而增高。
　　對(duì)照組小鼠脊髓中ARSB陽(yáng)性細(xì)胞的分布特征：在對(duì)照組小鼠的頸段和胸段，60-70天年齡段的小鼠在中央管、灰質(zhì)前角、灰質(zhì)后角3個(gè)不同解剖區(qū)域內(nèi)的ARSB陽(yáng)性細(xì)胞百分率有顯著差異，且灰質(zhì)前角>灰質(zhì)后角>中央

9、管。在對(duì)照組小鼠的腰段，不同年齡段的小鼠，其灰質(zhì)后角區(qū)域ARSB陽(yáng)性細(xì)胞百分率有顯著差異，且呈隨年齡增加而增高的趨勢(shì)。
　　疾病作為獨(dú)立因素存在時(shí)，對(duì)小鼠脊髓ARSB的陽(yáng)性細(xì)胞百分率有影響，且極其顯著（P=0.00），無(wú)論在實(shí)驗(yàn)組小鼠脊髓的頸段、胸段還是腰段，在同一解剖區(qū)域內(nèi)其脊髓ARSB陽(yáng)性細(xì)胞百分率平均值均高于正常對(duì)照組。解剖區(qū)域作為獨(dú)立因素存在時(shí)，對(duì)小鼠脊髓ARSB的陽(yáng)性細(xì)胞百分率有影響（P=0.01）， ARSB陽(yáng)性細(xì)胞的

10、分布在不同解剖區(qū)域內(nèi)的變化規(guī)律為：灰質(zhì)前角>中央管>灰質(zhì)后角。
　　結(jié)論：
　　本研究是首個(gè)基于SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠模型、運(yùn)用Western blot、免疫熒光技術(shù)進(jìn)行ALS疾病相關(guān)致病蛋白的系統(tǒng)性研究，得出結(jié)論如下：
　　首次闡明ARSB蛋白在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及正常對(duì)照小鼠脊髓不同不同節(jié)段、解剖區(qū)域及不同年齡時(shí)的表達(dá)和分布規(guī)律：ARSB蛋白在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)高于正常對(duì)照小鼠，并