丁苯酞對(duì)SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠脊髓Ferritin表達(dá)的影響.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是神經(jīng)系統(tǒng)慢性進(jìn)行性變性疾病，選擇性累及腦和脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。臨床表現(xiàn)為逐漸加重的肌無力、肌萎縮及錐體束征，最終累及呼吸肌，多于發(fā)病后3-5年內(nèi)死亡。其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，一般認(rèn)為與谷氨酸毒性，氧化應(yīng)激，細(xì)胞骨架異常，軸漿運(yùn)輸障礙等多種病因相關(guān)。目前，除利魯唑可延緩其疾病進(jìn)展外，缺乏有效治療。
　　 氧化應(yīng)激被認(rèn)為是多種神經(jīng)退行性疾病的

2、最后通路，其作為ALS發(fā)病機(jī)制之一也愈發(fā)受到關(guān)注。中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)活性氧敏感的原因:
　　 1）神經(jīng)元內(nèi)天然抗氧化劑谷胱甘肽含量低;
　　 2）細(xì)胞膜含有較高成分的不飽和脂肪酸;
　　 3）腦的高代謝使得需氧量相對(duì)增多。
　　 鐵是人體必須微量元素，具有多種生理功能，但是過多的鐵離子聚集會(huì)通過Fenton反應(yīng)生產(chǎn)羥自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成DNA，脂質(zhì)，蛋白質(zhì)的損傷。鐵穩(wěn)態(tài)的平衡有賴于多種鐵代謝相關(guān)蛋白，而

3、鐵蛋白(Ferritin)作為鐵代謝相關(guān)蛋白之一則發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其可以結(jié)合游離的二價(jià)鐵離子，阻止Fenton反應(yīng)及后續(xù)的氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而起到腦保護(hù)的作用。研究證實(shí)肌萎縮側(cè)索硬化患者體內(nèi)鐵代謝異常，血清鐵蛋白升高，而且，動(dòng)物模型中也證實(shí)鐵離子螯合劑可以阻止SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，延緩疾病進(jìn)展并延長壽命。
　　 丁苯酞(dl-3-n-Butylphthalide)是我國心腦血管領(lǐng)域中第一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)

4、的新藥，提取于芹菜種子中，相對(duì)分子質(zhì)量為190.24，具有多種神經(jīng)保護(hù)功能，可直接通過血—腦屏障，重構(gòu)缺血區(qū)微循環(huán)，保護(hù)線粒體免受損傷，改善能量代謝等。研究證實(shí)其可以明顯改善血管性癡呆患者的癥狀，提高其血清內(nèi)SOD的活性并降低MDA的含量，從而減少氧化應(yīng)激。
　　 在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)丁苯酞可以延長SOD1G93A轉(zhuǎn)基因模型鼠的壽命，本實(shí)驗(yàn)通過觀察丁苯酞對(duì)家族性肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因模型鼠SOD1G93A的發(fā)病時(shí)間和生存期及其

5、脊髓Ferritin表達(dá)的影響，旨在探討丁苯酞對(duì)SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的作用及其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、動(dòng)物分組及藥物干預(yù)
　　 經(jīng)PCR技術(shù)鑒定，選取SOD1G93A陽性小鼠72只，隨機(jī)分為丁苯酞組（發(fā)病早期及終末期），安慰劑組（發(fā)病早期及終末期），空白對(duì)照組（發(fā)病早期及終末期），每組12只，雌雄各半。于42天起應(yīng)用180mg/kg劑量的丁苯酞干預(yù)治療組，安慰劑組則給予10ml/kg的玉米油，

6、采用灌胃方法，一天一次，空白對(duì)照組自由攝取自來水。分別于發(fā)病早期（110天左右）及終末期取材。
　　 2、發(fā)病時(shí)間及生存期判定
　　 若SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)后肢癱瘓或走路不穩(wěn)的跡象則判定為發(fā)病[2]，小鼠從出生到發(fā)病的時(shí)間記錄為發(fā)病時(shí)間;將其仰臥位放置于平板上不能翻身，或體重丟失20％，視為終末期[2]，小鼠從出生到死亡的時(shí)間記錄為生存期。
　　 3、免疫組化
　　 采用10％水合氯醛麻醉小鼠后，

7、以4％多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定20～30分鐘后，取小鼠腰段脊髓固定于多聚甲醛內(nèi)48小時(shí)，震蕩切片25μm厚度，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察腰段脊髓Ferritin的表達(dá)情況，其中符合位于脊髓中央管以前、胞核及核仁著色清晰，直徑大于25μm的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元定為α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。
　　 4、免疫印跡
　　 采用10％水合氯醛麻醉小鼠后，即刻新鮮取材，取小鼠腰段脊髓，液氮冷凍，-80℃保存，采用免疫印跡的方法觀察腰段脊髓總蛋白中Ferrit

8、in的定量表達(dá)。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，生存時(shí)間采用Kapane-Meier(K-M)生存曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料應(yīng)用(X)±S表示，生化指標(biāo)應(yīng)用ANOVA進(jìn)行方差分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、發(fā)病時(shí)間與生存期
　　 發(fā)病時(shí)間:丁苯酞組為118.0±2.5，安慰劑組為109.5±2.2，空白對(duì)照組為107.1±1.

9、0;丁苯酞組與安慰劑組相比較，P=0.011，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;丁苯酞組和空白對(duì)照組相比，P=0.000，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而安慰劑組和空白對(duì)照組相比，P=0.209，＞0.05，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 生存時(shí)間:丁苯酞組為138.6±2.3，安慰劑組為128.1±2.8，空白對(duì)照組為127.4±2.3;丁苯酞組與安慰劑組相比較，P=0.034，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;丁苯酞組和空白對(duì)照組相比，P=0.

10、000，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而安慰劑組和空白對(duì)照組相比，P=0.555，＞0.05，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2、免疫組化
　　 發(fā)病初期，F(xiàn)erritin蛋白陽性的神經(jīng)元數(shù)目，丁苯酞組為23.83±1.75;安慰劑組為17.67±3.39;空白對(duì)照組為13.50±1.73;各組間相比較，P=0.000，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;安慰劑組和空白對(duì)照組中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)內(nèi)胞漿和胞膜周圍均勻著色，而丁苯酞組中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元

11、內(nèi)僅胞膜周圍著色，胞核和胞漿著色不明顯。
　　 終末期，F(xiàn)erritin蛋白陽性的神經(jīng)元數(shù)目，丁苯酞組為8.25±1.22;安慰劑組為5.33±0.78;空白對(duì)照組為4.67±1.16;各組間相比較，P=0.000，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;安慰劑組及空白對(duì)照組中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目較丁苯酞組相比減少，三者胞核及胞漿均有著色，并且可見膠質(zhì)細(xì)胞增生。
　　 3、免疫印跡
　　 發(fā)病初期，F(xiàn)erritin在腰髓表達(dá)量的

12、相對(duì)值，丁苯酞組為0.81±0.23;安慰劑組為1.57±0.43;陰性對(duì)照組為0.35±0.13;三者相比較，P=0.006，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;丁苯酞組與安慰劑組相比較，P=0.039，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;丁苯酞組與陰性對(duì)照組相比較，P=0.042，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;安慰劑組與陰性對(duì)照組相比較，P=0.006，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 終末期，F(xiàn)erritin在腰髓表達(dá)量的相對(duì)值，丁苯酞組

13、為1.45±0.45;安慰劑組為1.73±0.36;陰性對(duì)照組為0.78±0.36;三者相比較，P=0.023，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;丁苯酞組與安慰劑組相比較，P=0.449，＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;丁苯酞組與陰性對(duì)照組相比較，P=0.047，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;安慰劑組與陰性對(duì)照組相比較，P=0.010，＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:丁苯酞可以減少脊髓Ferritin的表達(dá)，延遲ALS小鼠的發(fā)病時(shí)間