Nrf2-ARE通路在老化和突變SOD1G93A星形膠質(zhì)細胞中的改變.pdf

1、星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要一種細胞。它們不僅對神經(jīng)元具有結(jié)構(gòu)上的支持和營養(yǎng)，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的完整性方面具有重要作用。星形膠質(zhì)細胞通過清除細胞外的谷氨酸和鉀參與離子平衡，并且與神經(jīng)元和其它膠質(zhì)細胞通過相互作用來進行著信息交流。星形膠質(zhì)細胞直接和間接參與了各種神經(jīng)變性疾病損傷的病理過程。
　　 建立純化的星形膠質(zhì)細胞是研究其生理和生化的關(guān)鍵。經(jīng)典的方法在純化星形膠質(zhì)細胞時消耗了大量的時間和資源，并且技術(shù)復(fù)雜，然而簡單

2、的方法存在成纖維細胞，小膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞，內(nèi)皮細胞室管膜細胞，以及神經(jīng)元的污染。為了解決這些問題，我們建立了一個酶消化為基礎(chǔ)的獲得90％純度的星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)方法。
　　 衰老是一個逐漸的、自然的變化過程，經(jīng)歷兒童期、青春期、成人期達到成熟，以后退化，經(jīng)過中年期而進入晚年。老化是隨著時間，機體細胞分裂、生長和功能喪失的過程，最后引起生命不相容性即老化過程，最終死亡。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高代謝，導(dǎo)致了它容易遭受氧化應(yīng)激的損傷。

3、自由基隨著老化不斷的產(chǎn)生。進而，過度產(chǎn)生超氧和過氧化氫在金屬離子的存在下產(chǎn)生了大量的羥自由基。在老化過程中，星形膠質(zhì)細胞的改變下降了它們的神經(jīng)元保護功能，這可能是神經(jīng)元老化改變的一個原因。氧化應(yīng)激參與了老化過程并且在神經(jīng)系統(tǒng)老化中伴有關(guān)鍵的作用。大量的證據(jù)表明，星形膠質(zhì)細胞在老化中的改變與氧化和抗氧化的平衡有關(guān)。并且星形膠質(zhì)細胞的激活程度與老化有關(guān)，表現(xiàn)為GFAP的升高。在小鼠和大鼠的離體培養(yǎng)中也表現(xiàn)類似的結(jié)果。然而脊髓中的星形膠質(zhì)細胞

4、在老化中的作用研究比較少見。
　　 面對于氧化應(yīng)激，NRF2從胞漿移入胞核，促進NQO1和HO1的轉(zhuǎn)錄增加。NQO1解毒醌及其衍生物，也可以有coenzyme Q的作用。NQO1催化α-tocopherolquinone生成強有力的抗氧化a-tocopher-olhydroquinone。HO1是一種氧化應(yīng)激蛋白，分解血紅素，生成膽綠素、自由鐵和一氧化氮。膽綠素和它代謝生成的膽紅素是一種生理的自由基清除劑，可以保護神經(jīng)元抵抗氧化

5、應(yīng)激。另外，Nrf2敲除小鼠表現(xiàn)了老化鼠的特征。Nrf2敲除鼠表現(xiàn)了氧化應(yīng)激耐受力的下降，這也類似于老化的大鼠。最近，Sykiotis and Bohmann等研究表明，Keap1/Nrf2通路在果蠅中被氧化劑激活，誘導(dǎo)了抗氧化能力。Keap1是Nrf2的抑制因子。當(dāng)Keap1敲除后，果蠅的壽命延長了。這樣，這個結(jié)果支持了Nrf2通路在延長壽命中的作用。
　　 星形膠質(zhì)細胞表達突變SOD1G93A選擇性的造成了對運動神經(jīng)元的損傷

6、。當(dāng)運動神經(jīng)元與突變SOD1星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)時，44％的運動神經(jīng)元發(fā)生了死亡。突變SOD1G93A星形膠質(zhì)細胞分泌了一些選擇性損傷運動神經(jīng)元的因子；相應(yīng)的，含有突變SOD1G93A的成纖維細胞、小膠質(zhì)細胞、皮層神經(jīng)元和肌肉細胞與運動神經(jīng)元共培養(yǎng)，并沒有表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)毒性。Di Giorgio也重復(fù)出了類似的結(jié)果。當(dāng)外界加入谷氨酸時，誘導(dǎo)了突變SOD1星形膠質(zhì)細胞的變性?？梢?，突變SOD1改變了星形膠質(zhì)細胞對運動神經(jīng)元的營養(yǎng)和保護作用

7、，同時也改變了星形膠質(zhì)細胞自身對外界刺激因素的抵抗能力。最近，Yamanaka K等研究表明，在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠中，選擇性的使星形膠質(zhì)細胞中不表達突變的SOD1，顯著的延緩了小膠質(zhì)細胞的激活和減慢了疾病進展。這樣，含有突變基因的星形膠質(zhì)細胞是研究突變SOD1毒性獲得機制的一個有用模型；針對表達突變SOD1的星形膠質(zhì)細胞進行干預(yù)也是治療運動神經(jīng)元變性的一條有效途徑。
　　 神經(jīng)母細胞瘤與胚胎期的運動神經(jīng)元雜交，形成運動神經(jīng)元樣細胞

8、系（NSC）。NSC-34具有了運動神經(jīng)元的特征：產(chǎn)生動作電位，表達神經(jīng)絲，合成和釋放乙酰膽堿等。另外，NSC-34誘導(dǎo)了共培養(yǎng)肌肉細胞的乙酰膽堿受體，以及在培養(yǎng)成熟過程中經(jīng)歷了微波蛋白到神經(jīng)絲的轉(zhuǎn)變。這樣既克服了原代運動神經(jīng)元培養(yǎng)的費時、費力、花費高、難培養(yǎng)等不足，又保留了原帶運動神經(jīng)元的特征。是研究肌萎縮側(cè)索硬化的常用細胞株。
　　 一、原代脊髓星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)和老化模型的建立
　　 目的：建立原代脊髓星形膠質(zhì)細胞

9、的培養(yǎng)和老化模型。
　　 材料與方法：原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，應(yīng)用免疫組化和Westernblot檢測GFAP的表達，應(yīng)用流式細胞學(xué)檢測老化細胞的線粒體膜電位。
　　 結(jié)果：星形膠質(zhì)細胞形態(tài)可見星狀、扁平狀和梭狀等；星形膠質(zhì)細胞的純度達到了90.1％； GFAP的表達水平隨著年齡的增加表現(xiàn)為上升的趨勢。符合老化的表現(xiàn)；30DIV和60 DIV的星形膠質(zhì)細胞與14DIV的星形膠質(zhì)細胞相比表現(xiàn)了線粒體膜電位的下降。老化的星形膠

10、質(zhì)細胞與14DIV的星形膠質(zhì)細胞相比，熒光強度降低了1倍，符合了老化的特征。
　　 結(jié)論：成功的建立了原代脊髓星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)和老化模型的建立。
　　 二、老化脊髓星形膠質(zhì)細胞表現(xiàn)為可逆轉(zhuǎn)的不充足的Nrf2轉(zhuǎn)錄活性
　　 目的：研究是否原代的星形膠質(zhì)細胞在離體培養(yǎng)14天，30天和60天表現(xiàn)了老化的特征，線粒體功能的失調(diào)和不充足的Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性；是否異常的Nrf2調(diào)節(jié)影響了它的轉(zhuǎn)位和老化過程。
　　 材

11、料與方法：建立原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)。應(yīng)用免疫組化和Western blot分析GFAP，EAAT2，F(xiàn)erritin和TfR以及Nrf2及其介導(dǎo)的HO1和NQO1的表達水平。應(yīng)用LDH檢測細胞損傷。應(yīng)用流式細胞學(xué)檢測線粒體膜電位。應(yīng)用MDA檢測試劑盒分析老化細胞的氧化水平。
　　 結(jié)果：WB顯示GFAP蛋白水平在離體培養(yǎng)30天和60天時與離體培養(yǎng)14天相比分別升高了1.6和1.7倍。在離體培養(yǎng)60天與30天相比GFAP蛋白表達水

12、平?jīng)]有顯著升高。WB顯示EAAT2在60DIV與30DIV相比表達下降。60DIV時，ferritin表達與30DIV和14DIV相比顯著升高，然而TfR的表達與30DIV相比顯著下降。與30DIV相比，老化的星形膠質(zhì)細胞Nrf2的表達下降。60DIV與30DIV和14DIV相比，總Nrf2表達下降了1和0.8倍。NQO1的表達與Nrf2的趨勢相似。與NQO1和Nrf2不同的是，HO1在60DIV和30DIV時與14DIV相比分別下降了

13、2.3和4倍。MDA的水平在60DIV與30DIV相比顯著升高，經(jīng)EGCG干預(yù)后，顯著下降。EGCG沒有誘導(dǎo)EAAT2的上調(diào)。EGCG使NQO1升高了1倍，GFAP的表達下降了0.3倍。EGCG促進了它的核的轉(zhuǎn)位增加。
　　 結(jié)論：星形膠質(zhì)細胞在離體培養(yǎng)30天時GFAP表達升高，隨后穩(wěn)定表達；EAAT2隨著年齡的增加表達減少；在正常老化，F(xiàn)erritin上調(diào)控制著鐵介導(dǎo)的毒性；線粒體功能進行性惡化；Nrf2活性以及它介導(dǎo)的二相酶

14、的表達在老化過程中不充足的：EGCG升高了Nrf2介導(dǎo)的抗氧化防御，下降了膠質(zhì)細胞的激活；通過Nrf2通路的抗氧化劑可以使老化的膠質(zhì)細胞受益，保護來自于老化損傷的線粒體仍是當(dāng)前最大的挑戰(zhàn)。
　　 三、表達突變SOD1的星形膠質(zhì)細胞表現(xiàn)了對氧化應(yīng)激的易損性
　　 目的：研究突變SODIG93A星形膠質(zhì)細胞是否表現(xiàn)了對氧化應(yīng)激的易損性。
　　 材料與方法：建立原代突變SOD1星形膠質(zhì)細胞和野生型SOD1星形膠質(zhì)細胞培

15、養(yǎng)。應(yīng)用MTT檢測氧化應(yīng)激對兩種類型細胞的影響。通過檢測ROS，分析EGCG的抗氧化作用。應(yīng)用Western blot分析兩種細胞中Nrf2及其介導(dǎo)的HO1和NQO1的表達水平，并進一步研究EGCG的保護機制。
　　 結(jié)果：與正常星形膠質(zhì)細胞相比，含有突變SOD1星形膠質(zhì)細胞MTT下降非常顯著。含突變蛋白的星形膠質(zhì)細胞中Nrf2表達下降了44％。Nrf2介導(dǎo)的HO1和NQO1的表達水平也分別下降了43％和40％。應(yīng)用EGCG5u

16、m和10um使NQO1的表達水平分別升高了1.5和2.5倍。EGCG也升高了Nrf2的表達并促進了Nrf2向細胞核中轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論：（1）突變SOD1是星形膠質(zhì)細胞對氧化應(yīng)激易受損性的內(nèi)在原因；（2） Nrf2下降及其介導(dǎo)的HO-1和NQO1表達的下降是星形膠質(zhì)細胞對氧化應(yīng)激易受損性的一個內(nèi)在機制；（3） EGCG能夠改善SOD1星形膠質(zhì)細胞的抗氧化能力。
　　 四、運動神經(jīng)元樣細胞株的培養(yǎng)
　　 目的：培養(yǎng)

17、運動神經(jīng)元樣細胞株，為進一步研究膠質(zhì)細胞對運動神經(jīng)元的影響創(chuàng)造條件。
　　 材料與方法：參照運動神經(jīng)元樣細胞株的培養(yǎng)程序，進行復(fù)蘇、傳代、消化、凍存等試驗，接種不同密度的運動神經(jīng)元樣細胞株，觀察生長和增值變化，應(yīng)用免疫細胞化學(xué)的方法進行SMI-32染色。
　　 結(jié)果：NSC-34表現(xiàn)了多角形，三角形，細長的突起，每個視野中可見到多種不同發(fā)育時期的細胞。不同接種密度的NSC34中，以8000/c㎡的細胞在24小時后恢復(fù)并增