Nrf2-ARE通路在大鼠心肌細(xì)胞缺氧-鋅預(yù)處理中作用的研究.pdf

1、目的：建立成年SD大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，觀察缺氧/硫酸鋅（HP/ZnSO4）預(yù)處理對大鼠心肌細(xì)胞的影響。以Nrf2為靶點，探討核因子E2-相關(guān)因子2（Nrf2）-抗氧化反應(yīng)元件（ARE）通路在HP/ZnSO4預(yù)處理心肌保護中的作用機制，以及藥物預(yù)處理替代缺氧預(yù)處理的可能性。
　　方法：
　　1.通過 Langendorff灌注離體心臟，分離、培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞，建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，將心肌細(xì)胞隨機分為6個組

2、，正常組（Nor組）、對照組（Con組）、缺氧預(yù)處理組（HP組）、ZnSO4(10μmol/L)預(yù)處理組（ZnP組），毛地黃酮(10μmol/L L)+HP（L+HP組）和L+ZnP組。分離后的心肌細(xì)胞培養(yǎng)20h，Nor組持續(xù)培養(yǎng)105min，對照組（Con組）將正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞置入95％N2+5%CO2缺氧培養(yǎng)箱中，缺氧45 min后再置于正常培養(yǎng)箱復(fù)氧60 min；缺氧預(yù)處理組（HP組）首先將細(xì)胞進(jìn)行三次短時間缺氧（2min/次）

3、，在每次短時間缺氧后分別復(fù)氧2min、3min、5min，余處理同 Con組；鋅預(yù)處理組（ZnP組）先將正常培養(yǎng)的細(xì)胞中加入終濃度為10μmol/L的ZnSO4，正常培養(yǎng)30 min，余處理同Con組。L+HP組和L+ZnP組在缺氧預(yù)處理和硫酸鋅預(yù)處理前加入終濃度為10μmol/L的毛地黃酮，然后在分別按照HP組和ZnP組處理。
　　2.透射電子顯微鏡觀察復(fù)氧末各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化并對其進(jìn)行線粒體評分。
　　3. LDH

4、試劑盒檢測復(fù)氧末各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH漏出率。
　　4. Real-Time PCR及Western blot技術(shù)檢測復(fù)氧末各組心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.透射電鏡觀察各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和線粒體Flameng評分:
　　1.1電鏡結(jié)果顯示Nor組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常，Con組超微結(jié)構(gòu)損傷最嚴(yán)重，L+HP組和L+ZnP損傷較嚴(yán)重，

5、HP組、ZnP組均優(yōu)于Con組和對應(yīng)阻斷劑組。
　　1.2線粒體Flameng評分結(jié)果：與Nor組相比，其余各組分?jǐn)?shù)顯著升高（P<0.05），HP組和ZnP組分?jǐn)?shù)明顯低于Con組和對應(yīng)阻斷劑組（P<0.05），L+HP組和L+ZnP組和Con組評分比較沒有差異（P>0.05）；
　　2.各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH漏出率：與Nor組相比，其余各組LDH漏出率均增加（P＜0.05)；與Con組以及L+HP組和L+ZnP組相比，H

6、P組和ZnP組漏出率降低（P＜0.05)；Con組與L+HP組和L+ZnP相比漏出率無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；
　　3. Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1 mRNA表達(dá)量的變化：與Nor組比較，Con組、HP組和ZnP組的Nrf2、HO1、NQO1及SOD1基因mRNA表達(dá)量均有所升高（P＜0.05）；與Con組相比，ZnP組和HP組Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1 mRNA表達(dá)量顯著增高（P＜0.05），并且

7、高于L+HP組和L+ZnP組（P＜0.05）。
　　4. Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化：與Nor組相比，Con組、HP組和ZnP組的Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1蛋白表達(dá)量均有所升高（P＜0.05)；與Con組相比，ZnP組和HP組Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著增高（P＜0.05），并且高于L+HP組和L+ZnP組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.