利用轉(zhuǎn)基因小鼠研究WNK1對腎臟水通道蛋白的調(diào)控作用.pdf

1、目的：
　　WNK激酶是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的成員， WNK1基因突變會導(dǎo)致一種人類常染色體顯性遺傳的新型家族性高血壓疾病，稱為假性醛固酮減少癥Ⅱ型(pseudohypoaldosteronism typeⅡ, PHAⅡ)。機體血壓平衡與腎臟水鈉代謝相關(guān)，已發(fā)現(xiàn)WNK1激酶在腎臟鈉離子的重吸收中起著重要的調(diào)控作用，然而WNK1是否調(diào)節(jié)腎臟水的轉(zhuǎn)運完全未知。本研究利用WNK1(1-491)腎臟特異性過表達的

2、轉(zhuǎn)基因小鼠探索WNK1激酶對腎臟水通道蛋白的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1、設(shè)計并構(gòu)建WNK1(1-491)腎臟特異性過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
　　2、利用無創(chuàng)血壓計測量小鼠血壓，用小鼠代謝籠測定小鼠飲水量、尿量，利用冰點滲透壓儀檢測小鼠血尿滲透壓，用酶聯(lián)免疫法檢測小鼠血漿AVP濃度。
　　3、通過分子生物學(xué)技術(shù)如實時熒光定量PCR、免疫印跡、組織免疫熒光等分別在mRNA、蛋白水平上分析腎臟水通道蛋白AQP1、A

3、QP2、AQP3、AQP4的表達情況。
　　4、設(shè)計脫水和灌水實驗，觀察野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的血壓、尿量、血尿滲透壓以及血漿AVP水平變化。
　　5、檢測脫水和灌水前后野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的腎臟水通道蛋白AQP1、AQP2、AQP3、AQP4的mRNA水平和蛋白水平的表達情況。
　　6、設(shè)計dDAVP注射實驗，檢測野生型小鼠注射前后WNK1激酶和水通道蛋白的mRNA水平和蛋白水平的表達情況
　　結(jié)果：
　　1、

4、WNK1(1-491)腎臟特異性過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建成功。
　　2、在正常情況下，與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠飲水量、尿量顯著下降，尿滲透壓明顯升高，血滲透壓下降，血漿AVP水平顯著升高。
　　3、在正常情況下，與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟水通道蛋白AQP2蛋白表達量顯著升高而AQP1、AQP3、AQP4無明顯差異。
　　4、相較于正常情況下，脫水后野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠尿量都下降、血尿滲透壓都上升，但轉(zhuǎn)基因小鼠

5、變化不如野生型小鼠明顯。此外野生型小鼠血AVP水平明顯升高，而轉(zhuǎn)基因小鼠血AVP濃度變化無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5、相較于正常情況下，脫水后野生型小鼠AQP1、AQP2、AQP4蛋白表達量明顯升高，而AQP3無明顯變化。而轉(zhuǎn)基因小鼠AQP4蛋白表達量明顯升高，而AQP1、AQP2、AQP3無明顯變化，即脫水消除了正常情況下野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠中AQP2的表達差異。
　　6、相較于正常情況下，灌水后兩組小鼠尿量都上升，尿滲透壓都下降

6、，血滲透壓都下降，血AVP均保持不變。但轉(zhuǎn)基因小鼠尿量上升不如野生型小鼠明顯，而血滲透壓下降更多。
　　7、相較于正常情況下，灌水后兩組小鼠腎臟AQP2、AQP4蛋白都下降，AQP3蛋白表達量明顯上升，而AQP1含量保持不變，且灌水后野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠間的AQP2差異縮小。
　　8、注射dDAVP后，野生型小鼠腎臟中WNK1和AQP2的表達量均顯著升高。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果表明WNK1（1-491）過